哺乳动物GV期卵母细胞玻璃化冷冻研究进展

张培培 ，郝海生，杜卫华，庞云渭，权国波，赵善江，朱化彬，赵学明*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，家畜胚胎工程与繁殖创新团队，北京 100193；2.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650224）

近年来，哺乳动物GV期卵母细胞的玻璃化冷冻保存技术取得很大进展，但在冷冻过程中也遇到很多问题。冷冻保护剂和冷冻-解冻过程均会对卵母细胞产生损害，影响卵母细胞存活及其发育能力[1]。前期研究表明，冷冻GV期卵母细胞会引起许多异常现象，如膜完整性丧失、皮质颗粒的分布改变、减数分裂纺锤体的混乱或消失，这可能导致染色体分散，非整倍性或多倍性[2-3]，同时，玻璃化冷冻对GV期卵母细胞表观遗传也会产生一定影响。本文综述了近年来哺乳动物GV期卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展，并对冷冻损伤及对策进行了系统分析，为哺乳动物GV期卵母细胞玻璃化冷冻的后续研究提供参考。

1 GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存的意义

1.1 家畜GV期卵母细胞玻璃化冷冻的意义 在卵母细胞生长发育过程中，GV期是卵母细胞在其细胞质中积累蛋白质和母体mRNA的一个阶段，被称为“分子成熟”的过程，当卵母细胞转录失活时，能够促进成熟卵母细胞受精后细胞周期的进展[4]。冷冻保存GV期卵母细胞可提供稳定的卵母细胞来源，建立卵子库，提高了卵母细胞的利用率，对季节性繁殖动物非常重要[5]。同时，GV期卵母细胞冷冻保存可用于濒危物种遗传物质保存，是维持家畜遗传资源多样性的重要手段。

1.2 人类GV期卵母细胞玻璃化冷冻的意义 冷冻保存GV期卵母细胞可满足不孕病人生育子女的要求。在人类辅助生殖中，GV期卵母细胞的冷冻保存具有一些临床优势，玻璃化冷冻GV期卵母细胞可减少药物对卵巢的刺激作用，降低卵巢过度刺激综合征和激素敏感性恶性肿瘤发生的风险[6]。此外，经过化学疗法或放射疗法治疗的患者无法获得正常的卵母细胞，而在化疗或放疗之前将GV期卵母细胞冷冻保存则可有效解决该问题[7]，因此在辅助生殖医学中得到了广泛的应用。

1.3 动物GV期卵母细胞玻璃化冷冻的优势 与MII期卵母细胞相比，GV期卵母细胞玻璃化冷冻具有独特的优势，主要是因为GV期卵母细胞处于减数分裂的双线期，尚未形成纺锤体，染色体解聚在核膜内，可有效避免玻璃化冷冻MII期卵母细胞所导致的纺锤体解聚、染色体失活、多倍体和非整倍体的形成等问题[8]。

2 GV期卵母细胞的玻璃化冷冻保存

自从1998年第一例GV期卵母细胞玻璃化冷冻取得成功以来，玻璃化冷冻GV期卵母细胞在人[9]、小鼠[10]、猪[11]均取得了成功，并获得了后代。

2.1 玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞 研究表明，小鼠GV期卵母细胞采用不同冷冻方法其冷冻效率差距较大。以细管为冷冻工具对小鼠GV期卵母细胞进行冷冻，采用二步法较一步法有更高的存活率（88.96%）和成熟率（73.23%）[12]。Nazmara等[13]用Cryotop法冷冻小鼠GV期卵母细胞，体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）后得到24.75%的囊胚率。最小体积法能够控制冷冻液滴的体积，可提高冷冻效率，用该方法冷冻小鼠GV期卵母细胞的囊胚率高达42.9%[10]。

2.2 玻璃化冷冻人GV期卵母细胞 研究表明，人GV期卵母细胞玻璃化冷冻后能够完成细胞核成熟并受精[14]。人GV卵母细胞采用封闭式细管法和开放式拉管（OPS）玻璃化冷冻时，解冻后成熟率分别为51%[15]、71%[16]，OPS法的冷冻速率较高且可减少细胞毒性损害。

2.3 玻璃化冷冻猪GV期卵母细胞 虽然猪卵母细胞对冷冻保存很敏感，但猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后仍具有在IVM期间完成细胞核和细胞质成熟的能力。Bali等[17]用OPS玻璃化法冷冻猪GV期卵母细胞，成熟率为54.5%，用固体表面冷冻法（SSV）得到53%的成熟率[18]。Somfai等[11]对猪GV期卵母细胞冷冻保存成功获得了后代。

2.4 玻璃化冷冻牛和绵羊GV期卵母细胞 至今为止，许多研究使用多种不同的玻璃化方法成功保存了牛的GV期卵母细胞，用OPS玻璃化冷冻牛GV期卵母细胞后囊胚率为6.1%[19]，Cryotop法冷冻时的囊胚率达到7.3%[20]。Abe等[21]用尼龙网冷冻工具冷冻牛GV期卵母细胞成功生出小牛，尼龙网面积大，有利于冷冻细胞的恢复和减少细胞损伤。

对于绵羊GV期卵母细胞玻璃化冷冻而言，用SSV玻璃化法时成熟率为23.7%、囊胚率5.4%[22]，而采用Cryoloop法冷冻时成熟率为43.4%、IVF后卵裂率为42.9%，囊胚率为29.4%[5]。

2.5 玻璃化冷冻单峰骆驼和马GV期卵母细胞 采用Cryotop玻璃化法对单峰骆驼GV期卵母细胞进行冷冻成熟率为51.8%、囊胚率6.4%[23]，Moawad等[24]用40%EG+40% DMSO的冷冻保护剂达到58.95%的成熟率。

研究表明玻璃化法冷冻马GV期卵母细胞，ICSI后卵裂率为55.6%～90.4%，囊胚率11.1%～34.6%[25-26]，不同的抗冻保护剂可能是导致其效率差异较大的原因。

3 GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存面临的问题

3.1 玻璃化冷冻对GV期卵母细胞细胞器的损伤

3.1.1 纺锤体和染色体 纺锤体和染色体都是卵母细胞必不可少的细胞器，可以反映核成熟的状态。纺锤体是在卵母细胞中期出现的一种独特的亚细胞结构，染色体排列在位于纺锤体中心的致密的赤道板上，纺锤体畸变与染色体多倍体和非整倍体有关[27]。

研究表明，人GV期卵母细胞经玻璃化冷冻、IVM之后，纺锤体和染色体的异常发生率分别达到78.9%和84.2%，较新鲜组（45%、50%）相比均提高30%左右[28]。同时，玻璃化冷冻也会导致马[29]的GV期卵母细胞IVM后纺锤体异常，破坏了卵母细胞核周围卵丘细胞的间隙连接。玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞，IVM后卵母细胞染色体非整倍率增加[30]。

3.1.2 皮质颗粒（CG）和线粒体 CG是卵母细胞胞质中的另一种重要细胞器，其迁移与卵母细胞成熟密切相关，是影响卵母细胞发育能力的重要因素，在GV期CG均匀分布在整个细胞质中，到MII期CG向外周迁移，玻璃化冷冻会引起CG提前释放导致透明带硬化，还会使细胞皱缩衰老变形。解冻会引发膜溶解，改变细胞膜通透性，使酶释放，降低了卵母细胞受精率[31]。也有研究表明冷冻不会影响猪GV期卵母细胞IVM后的CG分布，说明冷冻猪GV期卵母细胞内的CG能够正常完成迁移[3]。

线粒体是细胞质中最重要的细胞器之一。线粒体通过产生ATP、调节细胞代谢和维持内环境稳定在卵母细胞质中发挥重要作用。一些研究表明，卵母细胞的线粒体形态会受到玻璃化冷冻的影响，线粒体损伤或线粒体分布的变化可能对卵母细胞的活力和发育产生较大影响[32]。关于玻璃化冷冻对哺乳动物GV期卵母细胞线粒体分布的影响，存在物种差异。研究表明，玻璃化冷冻不会对小鼠[13]和人[33]GV期卵母细胞线粒体分布造成显著影响，但会造成银狐线粒体分布异常率高达64.6%[32]。

3.2 玻璃化冷冻对GV期卵母细胞蛋白的影响 研究表明，玻璃化冷冻绵羊GV期卵母细胞的IVM后，有62.9%的卵母细胞没有恢复减数分裂并停留在GV期，这可能是由于冷冻后蛋白质合成异常造成的[34]。关于玻璃化冷冻对哺乳动物GV期卵母细胞蛋白影响的研究较多，主要分为以下几个方面。

3.2.1 细胞骨架、β-肌动蛋白、缝隙连接蛋白 细胞骨架的稳定对卵母细胞玻璃化冷冻的成功至关重要，微管和细胞骨架纤维可以保护卵母细胞免受低温损伤[35]。玻璃化冷冻牛GV卵母细胞导致12个基因显著上调和19个基因下调，基于分子功能基因GO分析和KEGG数据库分析，差异表达的基因与细胞骨架的调节、凋亡有关，玻璃化冷冻导致牛GV期卵母细胞体外发育的降低[36]。

β-肌动蛋白（ACTB）是细胞骨架蛋白之一，参与细胞的运动、结构和完整性。玻璃化冷冻牦牛GV期卵母细胞解冻后卵母细胞中ACTB的表达显著降低，导致卵母细胞存活率降低[37]。

缝隙连接蛋白a1（GJA1）是参与组装间隙连接通道的蛋白之一，可以将营养物质从颗粒细胞转移到卵母细胞，维持其生长，调节卵母细胞减数分裂，也被认为是卵母细胞受精潜能和胚胎质量的基因标志物[38]。研究表明玻璃化冷冻牦牛GV期卵母细胞解冻后卵母细胞中GJA1的表达显著降低[37]。

3.2.2 卵母细胞成熟因子（MPF）和环磷酸腺苷（cAMP）MPF是细胞周期中重要的调节减数分裂的因子，在减数分裂成熟过程中起主导作用。MPF是细胞周期控制基因蛋白p34cdc2与细胞周期蛋白B组成的复合体。MPF活性降低是玻璃化GV期卵母细胞发育能力降低的原因之一[39]。

cAMP作为促性腺激素刺激的细胞内信使，在卵母细胞中合成，并通过缝隙连接由卵丘细胞提供给卵母细胞。玻璃化冷冻GV期卵母细胞导致卵母细胞内cAMP水平下降，IVM后MPF和促细胞分裂激活蛋白酶（MAPK）的活性降低，说明冷冻GV期卵母细胞导致参与激酶活性调控的信号通路的分子降解[39]。

3.2.3 卵母细胞受精蛋白 CD9和CD81蛋白是哺乳动物受精所必需的，这2种四聚体蛋白在精卵膜融合中起关键作用。CD9在卵母细胞早期生长和减数分裂成熟过程中表达，缺乏CD9会使卵母细胞的膜融合能力丧失，严重降低其生育能力[3]。CD81在卵母细胞表面表达，小鼠的CD81基因缺失导致生育力下降40%[40]。玻璃化冷冻牛GV期卵母细胞改变了其受精相关基因CD9和CD81的mRNA表达，导致成熟率，受精率降低，发育能力下降[41]。玻璃化冷冻猪GV期卵母细胞[3]经IVM后CD9蛋白的表达水平没有降低，其受精能力未受到影响。

3.2.4 细胞角蛋白（CK）CK是上皮细胞中的主要结构蛋白细胞，也存在于卵母细胞和早期胚胎中，在卵母细胞成熟过程中维持细胞完整性[42]。CK在卵母细胞中的分布模式是根据其核的结构重组的，从GV期的皮质模式到MII期的颗粒模式，CK的微丝网络从GV期延伸到MII期。玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞CK分布受到干扰，成熟到MII期不能形成颗粒状分布。玻璃化过程中剧烈的温度变化会CK微丝造成损害，使GV期卵母细胞缺乏完整的微丝网络[43]。

3.3 玻璃化冷冻对GV期卵母细胞表观遗传的影响 表观遗传修饰对胚胎发育至关重要，主要的表观遗传重编程发生在配子和胚胎发育早期。玻璃化冷冻卵母细胞会改变细胞DNA甲基化，导致表观遗传发生异常，降低卵母细胞的发育能力[44]。DNA甲基化是参与胚胎生长和发育的表观遗传修饰的主要机制之一，对印迹基因的活性状态和抑制状态的调控和维持具有重要的影响[45]。

3.2.1 单个基因甲基化 H19DMR和KvDMR1位于人类染色体11p15.5上，H19DMR在父亲等位基因上甲基化，调控H19和IGF2基因的表达，这2种基因在调节胎儿生长方面起着关键作用[46]。研究表明，玻璃化冷冻人GV期卵母细胞，解冻后体外成熟不会对H19DMR和KvDMR1造成影响[47]。

3.2.2 DNA甲基化 全基因组DNA甲基化与全基因组胞嘧啶的甲基化有关，包括印迹基因胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤（CpG）位点的胞嘧啶、重复序列和一些非CpG位点的胞嘧啶[48]。研究表明，玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞不会影响其MII卵母细胞全基因组DNA甲基化的建立[49]，玻璃化冷冻人GV期卵母细胞也不会影响其MII卵母细胞全基因组DNA甲基化的模式[29]。

4 提高GV期卵母细胞玻璃化冷冻效率的方法

4.1 甘氨酸处理 研究表明，小鼠GV期卵母细胞玻璃化冷冻过程中，采用1 mmol/L甘氨酸处理可降低IVM后卵母细胞的早期凋亡比例，提高IVF后囊胚率[50]。冷冻水貂GV期卵母细胞时，在玻璃化培养基中添加甘氨酸可以减少冷冻对线粒体的损伤，在玻璃化和成熟培养基中添加甘氨酸可以促进细胞核成熟率，且添加甘氨酸组的染色体正常分布率和皮质区正常分布率均高于未添加组[51]。由此可见，甘氨酸处理可提高玻璃化冷冻GV期卵母细胞的成熟率及其随后的胚胎发育能力。

4.2 含胆固醇的β甲基环糊精（CLC）处理 在培养基中添加胆固醇可通过改变膜磷脂相互作用的方式，提高膜在较低温度下的流动性，使膜在较低温度下收缩得更少，用CLC处理冷冻GV期卵母细胞DNMT3A、BAX表达水平与新鲜GV期卵母细胞相似[20]。该研究表明，添加CLC可减少玻璃化冷冻的GV期卵母细胞细胞膜损伤，有助于提高胚胎质量。

4.3 抗冻蛋白 抗冻蛋白(AFP)是一类多肽，存在于南极鱼类、昆虫和植物的组织和血液中，可使组织在低温环境中存活[52]。AFP可在GV期阶段保持纺锤体、染色体和膜完整性，在玻璃化培养基中添加AFP对冷冻小鼠GV期卵母细胞有保护作用，促进其对冷冻损伤的抵抗力[52]。用AFP处理冷冻GV期卵母细胞的抗凋亡基因Bcl2表达增加，提高了冷冻GV期卵母细胞的存活率、卵裂率和囊胚率[53]。由此可见，在玻璃化冷冻GV期卵母细胞过程中添加AFP可减少其冷冻损伤、提高发育能力。

5 展 望

近年来，随着社会对于优良家畜种质资源保存以及人类生殖力保存的日益重视，哺乳动物GV期卵母细胞的研究必将日益深入。玻璃化冷冻会对GV期卵母细胞在细胞生物学和分子遗传学乃至表观遗传学方面造成影响，这也成为今后本领域的研究方向。随着上述问题的解决，将有助于推动玻璃化冷冻GV期卵母细胞的广泛应用，从而为畜牧业和人类社会的可持续发展提供技术保障。