胚胎反复种植失败的子宫内膜免疫因素及其研究进展

臧朝雯，代彩凤，高景悦，邓晓惠

胚胎反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）是影响体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）后临床妊娠率提高的重要限制因素。目前RIF的定义国内外尚无统一标准，Coughlan等[1]提出，40岁以下不孕患者至少经历3个新鲜或冻融周期、累计至少移植4枚优质胚胎而未能实现临床妊娠即可诊断为RIF。而Polanski等[2]对119篇相关文献进行荟萃分析后提出，RIF应被定义为在连续两次移植质量良好、发育阶段适宜的胚胎而未能实现临床妊娠，且累计移植胚胎数不少于4个，累计移植囊胚数不少于2个。在接受IVF/卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治疗的患者中，RIF的发生率可高达10%[3]。子宫内膜免疫因素与胚胎着床的关系近年来备受关注。大量研究表明，子宫内膜中的免疫细胞和细胞因子对胚胎黏附、滋养细胞侵入、血管重构和免疫耐受的影响，是决定胚胎植入和发育的重要因素。现就子宫内膜免疫环境与RIF关系的研究进展进行综述。

1 免疫细胞

子宫内膜中存在多种免疫细胞，包括自然杀伤细 胞（nature killer cell，NK细 胞）、巨 噬 细 胞（macrophage，Mφ）、树突状细胞（dendritic cell，DC）和T细胞等，除T细胞外，其他免疫细胞的数量均随着月经周期呈现周期性变化。这些免疫细胞在调节子宫内膜容受性和胚胎植入中发挥重要作用。

1.1 NK细胞NK细胞是先天性淋巴细胞家族成员之一，是一种细胞毒性天然淋巴细胞，通过分泌细胞因子和杀伤靶细胞，在自然免疫应答中发挥重要作用。人类NK细胞典型表型为CD3-CD56+，根据CD56表达水平，分为CD56bright亚群和CD56dim亚群。正常妊娠期间，大部分子宫自然杀伤细胞（uterine nature killer cell，uNK细胞）具有较弱的细胞毒性，表现为CD56brightNK细胞。既往大量研究表明，uNK细胞CD56bright亚群和CD56dim亚群的失衡可能导致种植失败。在所有主要子宫内膜免疫细胞群中，uNK细胞在排卵后表现出的增殖水平最高。Strunz等[4]研究发现，分化程度较低的KIR-CD39-uNK细胞具有更强的促炎能力，能够产生γ干扰素（interferon γ，IFNγ）、趋化因子3（chemokines 3，CCL3）、CCL4和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），其在月经周期中的卵泡期占优势；而KIR+CD39+uNK细胞则与免疫耐受和增强血管生成有关，其产生的半乳糖凝集素1（galectin-1）可诱导耐受性树突状细胞（tDC）和调节性T细胞（Treg），产生的Tim-3配体galectin-9对1型辅助性T细胞（helper T cell 1，Th1）免疫应答起负性调节作用，使Th1/Th2比例降低，有利于胚胎植入。Babayeva等[5]通过免疫组织化学证实，RIF患者黄体期uNK细胞的减少与反复种植失败有关。目前临床常基于NK细胞水平异常而给予RIF患者免疫治疗。Woon等[6]的一项荟萃研究认为，基于NK细胞数量异常而选择的免疫治疗对RIF患者的妊娠结局可能是有益的，但在这方面缺乏高质量的研究，没有明确的高级别循证医学证据，仍需要进一步研究。

1.2 MφMφ在黄体期子宫内膜中数量显著增加，在妊娠后约占人类蜕膜白细胞的20%～30%，其数量在人类蜕膜的白细胞群中位居第二。蜕膜Mφ具有高度可塑性，其分化取决于局部微环境因素，可分化为许多不同的中间型亚型，M1型Mφ即经典激活型，表现为促炎效应，M2型Mφ即交替激活型，表现为抗炎效应，这两种亚型是Mφ极化的两种极端亚型，M1型Mφ和M2型Mφ之间的极化平衡在滋养层侵袭和迁移中起重要作用。大量研究表明，在异常妊娠失败的蜕膜中，Mφ常呈现异常极化状态，表现为M1型Mφ比例升高或M2型Mφ比例下降[7]。Ding等[8]发现，滋养层细胞分泌白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）诱导Mφ分化为M2型Mφ，而分化的M2型Mφ分泌粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/细胞外信号调节激酶1/2（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/extracellular signal-regulated kinase1/2，PI3K/AKT/ERK1/2）信号通路，推动滋养层细胞的侵袭和迁移，促进胚胎着床。而M1型Mφ衍生的细胞外囊泡通过转运微小RNA146a-5p（miR146a-5p）和miR146b-5p，在转录水平抑制TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）的表达，从而抑制滋养层间质转化、侵袭和迁移，导致胚胎着床失败或流产[9]。

1.3 DCDC是免疫应答启动和调节的关键因子，作为免疫系统中最有效的抗原提呈细胞，DC不仅参与原发性免疫应答的启动，而且在诱导免疫耐受和调节T细胞介导的免疫应答方面也有重要作用。在以G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、IL-4、IL-10和 转 化 生 长 因 子β（transforming growth factor-β，TGF-β）为主的细胞因子环境中，DC能够在吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的诱导下获得tDC的表型，并能够驱动原始Th向Treg分化，从而维持免疫耐受，有利于胚胎植入[10]。DC还可以影响Th1/Th2平衡，在人类妊娠早期，DC能产生较低水平的Th1倾斜细胞因子IL-12p70，调节Th1/Th2平衡，维持Th2主导状态，进而维持正常妊娠[11]。研究发现，RIF患者黄体期外周血和子宫内膜中的免疫球蛋白样转录本4（immunoglobulin-like transcript 4，ILT-4）+DC均减少，并推测ILT4+DC通过诱导叉头框蛋白P3（forkhead box protein P3，FOXP3）+Treg有助于维持人类妊娠免疫耐受[12]。而ILT4+DC诱导FOXP3+Treg的分子机制目前尚未明确，有待更深入的研究。

1.4 T细胞在妊娠早期，人类蜕膜中约10%～20%的白细胞是T细胞，30%～45%是CD4+T细胞，45%～75%是CD8+T细胞，其中约5%的CD4+T细胞是具有免疫抑制特性的Treg，这些百分比在整个妊娠过程中保持相对不变。

1.4.1 Th1和Th2细胞Th细胞参与母体妊娠免疫的形成，Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫，诱导炎症反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-10和IL-13等细胞因子，表现为抗炎作用。正常妊娠着床窗口期，由于胎盘分泌孕酮等促进Th2反应的细胞因子，子宫内膜免疫的改变通常会使Th1/Th2细胞平衡向Th2偏移，Th2细胞增多[13]。研究表明，RIF患者外周血中Th1细胞因子的表达高于Th2细胞因子，表现为促炎状态[14]，说明Th1/Th2失衡主要通过改变细胞因子的表达造成RIF的发生。郭玲等[15]的一项研究也显示，在着床窗口期，RIF患者外周血中的Th1细胞因子明显高于Th2细胞因子，而第一次接受IVF/ICSI助孕即成功获得妊娠的患者Th1/Th2平衡向Th2偏移。反复暴露于半同种异体胚胎可诱导全身免疫排斥反应，并分泌促炎性Th1细胞因子，使Th1细胞因子升高，从而破坏Th1/Th2平衡，影响胚胎着床。当抗原入侵免疫系统，CD4+T细胞增加，产生Th1细胞，而抗原进一步暴露超过阈值会导致CD4+T细胞的部分耗竭，造成Th1细胞增多[16]，这可以在一定程度上解释为什么RIF患者的子宫内膜中Th1/Th2比例失衡。研究表明，对RIF患者使用羟氯喹[17]和他克莫司[18]等药物可以降低Th1/Th2比值，从而改善ET结局。而最近有研究表明，多次流产和胚胎植入失败可能会增加心理压力，应激诱导的焦虑通过增加促炎性Th1细胞因子的产生和减少抗炎性Th2细胞因子的分泌，促进免疫反应[19]。此外，研究发现，维生素D缺乏可使Th1/Th2比值升高，导致RIF的发生[20]。因此，在ET前补充维生素D可能通过改变Th1/Th2比值提高子宫内膜容受性，从而对预防RIF的发生有一定益处。

1.4.2 Treg细胞Treg细胞曾被称为抑制性T细胞，在调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫性疾病中发挥重要作用，在妊娠早期到妊娠中期蜕膜组织中数量逐渐增加，在胚胎植入、妊娠维持中不可或缺。Treg细胞的数量和功能异常与RIF有关。RIF患者黄体期子宫内膜组织中的Treg细胞密度和免疫抑制功能均降低[21]。Ghanavatinejad等[22]研究发现，经血干细胞（menstrual blood stromal stem cell，MenSC）能够产生基础水平的IL-6，诱导信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）介导的T细胞产生IL-10，进一步诱导Treg细胞的分化，MenSC还能够增加Treg/CD4+IL-17+T细胞比例，有利于妊娠。

1.4.3 Th17细胞在Th细胞亚群中，产生IL-17的Th17细胞属于促炎性Th亚群，产生标志性细胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22。Th17细胞与感染性免疫有关，健康人群的外周血中Th17细胞较少，而蜕膜中的Th17细胞密度高于外周血。RIF患者外周血中的Th17细胞比例高于正常生育者，对RIF患者应用强的松可以使Th17/Treg平衡向Treg偏移，改善妊娠结局[23]。MenSC能够抑制Th17细胞的分化，对妊娠产生有利影响[22]。羟氯喹可通过改变维甲酸相关核孤儿受体γt（retinoic acid-related nuclear orphan receptor γt，RORγt）和FOXP3 mRNA的表达来降低RORγt/FOXP3比值，从而降低Th17/Treg比值，提高RIF患者的胚胎植入率[24]。

2 细胞因子

2.1 IL-6IL-6在非免疫细胞和免疫细胞之间的相互作用中发挥重要作用，非免疫细胞中增强的IL-6信号，一方面通过增加活化的T细胞如Th17细胞导致炎症的发生，另一方面通过IL-6/STAT3通路加强激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路，促进其他促炎因子的表达。在RIF患者的内膜组织中，IL-6呈高水平表达，且STAT3水平也高于正常生育者，而作为阻断Treg细胞发育并诱导Th17细胞分化的关键细胞因子，IL-6的高表达使Th17细胞增多，可造成不良妊娠结局[25]。Zhou等[26]发现，孕酮诱导阻断因子1（progesterone-induced blocking factor 1，PIBF1）可能通过IL-6/p-STAT3通路在RIF的发生中发挥作用，PIBF1在RIF患者黄体期子宫内膜组织间质中的表达明显低于上皮细胞，PIBF1的减少可以通过IL-6/p-STAT3通路抑制人子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cell，hESC）的增殖和蜕膜化，对胚胎着床产生负面影响，而RIF患者黄体期子宫内膜PIBF1下调的原因还有待进一步研究。

2.2 IL-10IL-10是一种抗炎性细胞因子，由多种免疫细胞表达，如适应性免疫系统的Th1、Th2、Th17、Treg细胞和CD8+T细胞，以及固有免疫系统的DC、Mφ和NK细胞等。IL-10对T细胞有直接作用，抑制Th17和Th1细胞，刺激Treg细胞和CD8+T细胞。IL-10水平与着床率呈显著正相关，正常生育者分泌期子宫内膜的IL-10水平比RIF患者高[27]。而近年来一些研究发现产生IL-10的调节性B细胞（regulatory B cell，Breg）通过诱导免疫耐受在维持妊娠中发挥重要作用。Koushaeian等[28]发现RIF患者产生IL-10的B细胞数量减少，IL-10表达下调可能在RIF的发病机制中发挥作用。他克莫司可以显著提高RIF患者子宫内膜中的IL-10表达，降低IFN-γ/IL-10比值，从而提高胚胎植入率[18]。

2.3 IL-15IL-15是一种促炎因子，同时在子宫内膜基质细胞和上皮细胞中表达，大多数情况下，其在上皮细胞中的表达高于基质细胞，但在蜕膜化后的基质细胞中表达增加，黄体中期是月经周期中子宫内膜IL-15表达最高的时期。IL-15是NK细胞增殖的强诱导剂，直接参与排卵后uNK细胞的募集和成熟，对充足的Th2细胞因子的产生至关重要。研究发现，IL-15介导NK细胞数量的增加及其激活状态的增强[29]，为RIF的治疗提供了新的方向。

2.4 IL-17IL-17由Th17细胞产生，IL-17通过诱导编码促炎细胞因子（TNF、IL-1、IL-6、G-CSF和GM-CSF）、趋化因子（CXCL1、CXCL5、IL-8、CCL2和CCL7）及抗菌肽（防御素和S100蛋白）的基因表达，参与炎症的发生。RIF患者外周血中IL-17升高，其黄体期子宫内膜中IL-17的表达显著增加，外周血和内膜高水平的IL-17可能提示异常的局部或全身炎症反应，导致胚胎着床失败，而外周血IL-17升高还可能预示随后辅助生殖技术周期失败的风险增加[30]。羟氯喹可以显著降低RIF患者的IL-17水平，升高IL-10水平，降低IL-17/IL-10比值，从而提高胚胎植入率[24]。

2.5 TNF-αTNF-α最初作为一种抗癌因子被发现，后来被证实与多种炎症及免疫性疾病有关，主要通过NF-κB发挥其致癌、致炎作用。研究证实，TNFα升高提示免疫系统过度活跃，可增加植入失败的风险，并且与不孕相关，大多数RIF患者存在TNF-α的过度表达，从而使子宫内膜容受性降低；此外，外周血TNF-α/IL-10比值升高与RIF的发生相关[31]。Santiago等[32]发现在内膜准备过程中对RIF患者使用TNF-α拮抗剂依那西普可以改善其IVF结局，推测TNF-α与RIF的发生相关。

2.6 IFN-γIFN-γ是一种由NK细胞和Th1细胞产生的糖基化蛋白，Th1细胞能够产生IFN-γ，Th2细胞则对IFN-γ产生应答，使其增殖受到抑制。IFN-γ在着床期血管重塑中起重要作用，可以增加绒毛外细胞滋养层（extravillous trophoblast，EVT）凋亡并降低蛋白酶活性，进而调节EVT侵袭，从而在早期胎盘形成和滋养细胞侵袭过程中发挥作用。IFN-γ还具有强大的促炎作用，增加天然免疫细胞中人类白细胞抗原（HLA）Ⅰ类和Ⅱ类抗原及Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）的表达，促进同型转换，诱导分泌趋化因子，激活Mφ并增强其吞噬作用[33]。RIF患者子宫内膜中IFN-γ表达水平较高，有研究表明降低IFN-γ水平有利于胚胎植入[18]。

2.7 G-CSFG-CSF是一种造血特异性细胞因子，主要由骨髓细胞、基质细胞、成纤维细胞和Mφ产生，一些非造血细胞，如内皮细胞、胎盘细胞、滋养细胞和颗粒叶黄素细胞也表达G-CSF受体。G-CSF主要帮助干细胞的动员、迁移和分化，在子宫内膜中通过促进血管生成促进子宫内膜再生，降低凋亡活性，减少细胞死亡，同时通过对淋巴细胞、Mφ和Th2细胞的作用暂时抑制免疫反应，促进胚胎着床和维持妊娠。近年来，关于G-CSF应用于RIF患者的研究也广泛开展起来。Kalem等[34]的一项随机对照研究认为，子宫内膜厚度正常的RIF患者宫腔灌注G-CSF对于子宫内膜厚度、临床妊娠率和活产率的改善没有明显益处。而Jiang等[35]荟萃分析表明，宫腔灌注和皮下注射G-CSF，尤其是皮下注射时，RIF患者的胚胎植入率和临床妊娠率均有提高。然而，对于宫腔灌注或皮下注射G-CSF的不良反应鲜有报道，因此其用于治疗RIF的安全性和必要性仍有待进一步研究。

3 其他

3.1 NF-κBNF-κB蛋白家族与逆转录病毒癌蛋白v-Rel在结构上具有同源性，可以选择性与B细胞κ轻链增强子结合，调控许多基因的表达。NF-κB位于细胞质中，调节包括子宫内膜在内许多组织的免疫和炎症反应，NF-κB在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）-TLR4通路引发的炎症反应中发挥重要作用，NF-κB的激活可调节炎症基因的表达，并促进IL-1β、IL-6和IL-8等细胞因子的释放[36]。RIF患者子宫内膜NF-κB的表达水平显著升高[37]，这可能提示子宫内膜容受性受损。研究发现，昼夜节律基因Reverbα的激活可以通过抑制TLR4-NF-κB活化减少NF-κB驱动的炎性细胞因子在hESC中产生，抑制炎症反应，从而有利于胚胎着床[38]，这一研究发现为RIF患者的治疗提供了新的思路。

3.2 细胞毒性颗粒NK细胞和细胞毒性T细胞表达较少的细胞毒性颗粒，如穿孔素（Pfr）和颗粒酶B（GrB），在妊娠维持过程中表现出有限的细胞毒性。近年部分学者逐渐发现细胞毒性颗粒在胚胎种植方面可能发挥一定的作用。γδ-T细胞是由表达γ链和δ链的T细胞受体（TCR）组成的非常规T细胞的一部分，既往研究证实其可以通过分泌细胞毒性颗粒和细胞因子在许多免疫调节过程中发挥关键作用[39]。在正常妊娠期间，γδ-T细胞表达较低水平的GrB[40]。Huang等[41]研究发现，妊娠失败的RIF患者外周血中的GrB+γδ-T细胞比例明显高于成功妊娠的RIF患者，因而推测表达GrB的γδ-T细胞可以作为RIF患者临床妊娠失败的预测因子。细胞毒性颗粒与RIF关系尚未明确，缺乏高质量的研究，仍需进一步研究。

4 结语

RIF是辅助生殖领域亟待解决的重要问题，其发病机制尚不完全明确，目前大量研究表明，子宫内膜免疫失衡在RIF的发生中发挥重要作用，临床上一些经验性免疫治疗也取得了一定的疗效，但目前对于RIF患者是否应使用免疫治疗尚无高级别循证医学证据。因此，未来仍需要对RIF子宫内膜免疫机制进行深入研究以及更多高质量随机对照研究，以期为临床治疗提供更安全有效的个体化治疗方案。