RF酰胺相关肽3调节雌性哺乳动物生殖活动的研究进展

李杨，杨洪艳

在雌性哺乳动物中，生殖衰老是一个复杂的过程，涉及进行性卵巢功能障碍，是体内状态和体外环境综合作用的结果，而这种综合作用通过下丘脑-垂体-卵巢（hypothalamus-pituitary-ovary，HPO）轴的神经内分泌因子之间的相对平衡来调控[1]，促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）被认为是HPO轴的控制因子，在生殖中的重要性已被广泛研究[2]。2000年日本学者在日本鹌鹑大脑中发现促性腺激素抑制激素（gonadotropininhibitory hormone，GnIH），证实其对HPO轴产生抑制调节作用[3]。紧接着该团队在哺乳动物中发现了GnIH同源物，命名为RF酰胺相关肽（RFamiderelated peptide，RFRP），其 由RFRP神 经 元 分 泌，RFRP基因编码2条有生物活性的短肽——RFRP-1和RFRP-3，但只有RFRP-3具有生化特征[4]。近5年研究人员主要对RFRP-3在人类、羊、大鼠和小鼠等哺乳动物下丘脑中的分布和功能进行了一定的研究。

下丘脑中RFRP-3神经元的分布在不同物种间略有不同，但几乎所有研究都表明下丘脑背内侧核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH）是RFRP-3神经元聚集的关键区域，通过受体药理特性的系统比较研究以及信号转导途径中结合亲和力和有效性的研究表明，G蛋白耦联受体147（G protein-coupled receptor 147，GPR147）是RFRP-3的功能性受体[5]。RFRP-3对生殖的影响似乎并不清晰，归因于物种、环境条件和实验技术手段不同，以及不同的药物浓度和作用位点（中枢或者外周）[6]。本文重点介绍RFRP-3在雌性哺乳动物生殖调节、能量平衡和应激调节3个方面的重要研究进展。

1 RFRP-3对女性生殖发育的调节作用

1.1 RFRP-3对下丘脑-垂体性腺轴的调节作用其通常直接或间接抑制哺乳动物GnRH/黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）的合成和分泌。一方面，RFRP-3神经纤维与GnRH神经元突起周围紧密接触，且1/3的GnRH神经元细胞体表达GPR147，表明RFRP-3对GnRH系统有直接作用。小鼠实验表明，RFRP-3对40%的GnRH神经元放电频率具有快速、可重复的抑制作用，进而抑制LH分泌[7]。另一方面，研究发现RFRP-3神经元的投射与小鼠、绵羊和猴子的Kisspeptin神经元形成密切的联系，其中在小鼠的弓状核（arcuate nucleus，ARC）约有25%的Kisspeptin神经元表达GPR147[8]，表明RFRP-3还可能通过Kisspeptin抑制GnRH的活性。Zmijewska团队的2项研究表明，RFRP-3通过Kisspeptin影响动情周期内猪垂体细胞LH及卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的合成和分泌[9-10]。除了对GnRH神经元的作用外，RFRP-3还可能直接通过垂体改变促性腺激素的合成和分泌，研究表明，RFRP-3可直接作用于大鼠垂体，抑制促性腺激素的释放[7]。RFRP-3对循环排卵时LH峰的抑制似乎不通过GnRH系统发挥作用，因为在内侧视前区GnRH和RFRP-3受体GPR147 mRNA的表达无差异，推测RFRP-3可能直接影响垂体促性腺激素细胞[11]。综上，RFRP-3至少存在3条调控雌性哺乳动物LH分泌的途径，即RFRP-3-Kisspeptin-GnRH-LH、RFRP-3-GnRH-LH和RFRP-3-LH。当然，性别差异也可能使得以上3种作用途径在雄性哺乳动物体内不完全一致。

1.2 RFRP-3在青春期生殖系统发育中的作用哺乳动物从出生到生命结束均受到神经内分泌系统的调控，而青春期受生殖神经内分泌系统的调控尤为明显，这是一个复杂而有组织的过程。当前研究证实，青春期是通过高频GnRH脉冲来调节的，而作为GnRH上游的一种抑制因子，RFRP-3抑制青春期前哺乳动物促性腺激素分泌。然而，RFRP-3是如何调节青春期前哺乳动物GnRH分泌的？2012年Losa-Ward等[12]发现经双酚A诱导的青春期早熟大鼠脑内RFRP-3的纤维密度降低，其与GnRH神经元的接触减少，从而对GnRH神经元的抑制作用减弱，出现性早熟症状。而2014年发表的2项研究表明，编码人类RFRP-3和GPR147的基因发生变异与GnRH依赖型青春期疾病的发生无关，同时GPR147基因敲除小鼠的青春期启动时间没有改变[13-14]。2015年Semaan等[15]研究发现，在青春期前期，DMH中RFRP-3的表达和RFRP-3/c-fos的共表达均显著降低，这可能导致在青春期早期RFRP-3对GnRH神经元的抑制减少。另外，2017年Han等[16]研究发现，侧脑室注射RFRP-3可明显延缓幼年雌性大鼠的青春期启动，表现为血清LH和雌二醇（estradiol，E2）水平显著降低、子宫成熟延迟、阴道口开放时间推迟和血清生长激素水平升高。2020年Si等[17]的研究提示，青春期启动延迟，与γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神经元受到抑制引起RFRP-3 mRNA的转录水平发生变化有关。但RFRP-3控制青春期的GnRH分泌机制及相关神经肽的作用和特性仍然有待深入研究。

1.3 RFRP-3在卵巢相关疾病中的作用在雌性哺乳动物中，生殖衰老是一个复杂的过程，与HPO轴的中枢控制改变和昼夜节律系统的去同步化有关，涉及渐进性卵巢功能障碍。卵巢是卵子成熟及卵母细胞分化和释放的场所，卵巢内产生的类固醇从青春期发育到排卵和生殖周期的过程中发挥至关重要的作用。生殖失调在生殖激素表现为抗苗勒管激素和雌激素水平降低、促性腺激素和雄激素水平升高等，临床表现为早发性卵巢功能不全、多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）及卵泡成熟障碍导致的排卵障碍和不孕症等。

早发性卵巢功能不全与GnRH脉冲释放减少和HPO轴下游受损有关。然而，触发这一转变的神经内分泌机制尚未阐明。Geraghty等[18]研究了不同程度生殖衰退的中年雌性大鼠（包括周期正常、周期不规则和周期完全停止），结果发现在卵巢周期出现任何变化之前，大鼠大脑中的激素水平已经发生变化。在动情周期发生改变之前，大鼠下丘脑中RFRP-3 mRNA表达增加，但这种增加是短暂的，随之而来的是Kisspeptin和GnRH mRNA表达的下降。研究还发现，随着年龄的增长，RFRP-3及其受体GPR147在卵巢中的表达也局部增强，提示卵巢衰老可能是由GnRH系统上游的RFRP-3调节神经肽网络的改变引发的。此外，RFRP-3和GPR147在小鼠动情前期和动情期的卵巢颗粒细胞、有腔卵泡以及动情间期的黄体细胞中合成，提示它们参与了卵泡的发育和闭锁；在人卵巢颗粒细胞培养中发现，RFRP-3可抑制促性腺激素诱导的细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）积累和孕酮分泌[19]。以上结果表明，RFRP-3对卵巢发育起负向调控作用，且其表达水平会随年龄的变化而变化。

PCOS以高雄激素血症和排卵功能障碍为显著特征，与生殖、内分泌、心理和代谢紊乱紧密相关。已有研究显示，恒定光照诱导的PCOS大鼠DMH中RFRP-3基因表达降低，提示PCOS发病过程中RFRP-3基因表达降低可能导致其对GnRH的抑制作用弱化[20]。并且在注射睾酮建立的大鼠PCOS模型中，其下丘脑RFRP-3 mRNA表达减少[21]。因此笔者推测，RFRP-3参与调控PCOS疾病过程中类固醇激素合成分泌乃至卵巢多囊样改变的进程。基于RFRP-3对雌性HPO轴功能的影响，其他卵巢常见疾病诸如卵巢癌、卵巢囊肿等与RFRP-3及其受体的表达改变是否有关也是一个值得思考及研究的问题。

2 RFRP-3参与能量稳态的调节

生殖对生物体能量储备和新陈代谢状态的变化高度敏感，生殖能力缺陷往往与不利的能量稳态条件有关，在此背景下，关于RFRP-3系统对生殖功能影响的研究扩展到其在调节食欲及能量方面的潜在作用[22]。研究也显示，RFRP-3及其受体GPR147不仅分布在中枢神经系统，也分布于胃肠道、卵巢和胰腺等外周器官中[23]。

RFRP-3是生殖和能量平衡之间的中介，在食物受限的青春期前期母羊卵巢发育过程中，限食显著抑制了卵巢发育和卵泡生长，RFRP-3 mRNA表达上调，说明RFRP-3可能参与能量及卵泡发育的调节。侧脑室注射RFRP-3可显著增加雄性大鼠和绵羊的摄食量，提示内源性RFRP-3具有一定的促食欲作用[24]。电生理研究表明，RFRP-3抑制小鼠厌食神经元（如POMC），并减弱Kisspeptin对POMC神经元的兴奋作用，发挥促进摄食的作用[25]。但是，Kovács等[26]得出不同结论，该研究首次发现在大鼠杏仁核内微量注射RFRP-3显示出厌食特性。杏仁核的中央核区参与摄食和体质量的调节，其内注射50 ng和100 ng RFRP-3可导致大鼠摄食量显著减少。可见RFRP-3在静脉注射或显微注射到大脑不同部位时可导致不同的状态，中枢和外周注射RFRP-3对摄食量影响的确切机制仍值得进一步研究。

RFRP-3作为一种新的神经内分泌调节因子，还参与血糖动态平衡的调节。在一项RFRP-3对大鼠摄食量、膳食结构和体质量影响的研究中发现，腹腔注射RFRP-3可引起大鼠体质量明显增加、进食量增加、葡萄糖耐受不良、胰岛细胞增大以及胰岛炎性反应显著增加；免疫荧光双染数据显示，在胰岛中，RFRP-3主要与胰高血糖素共定位，而GPR147主要与胰岛素共定位，提示RFRP-3可能通过GPR147在大鼠胰岛β细胞上以自分泌和（或）旁分泌的方式发挥作用，从而抑制胰岛素的产生；此外，长期腹腔注射RFRP-3的大鼠在接受外源性葡萄糖14 d后，血糖水平也显著升高，提示腹腔注射RFRP-3不仅能诱导高血糖，而且能钝化大鼠对外源性葡萄糖的敏感性，降低糖清除反应[24]。笔者认为腹腔注射RFRP-3可能通过其受体调节外周激素（胰岛素和胰高血糖素）作用于外周内分泌腺体及细胞，从而为下丘脑相关的摄食反馈机制提供外周反馈信号，但是外周RFRP-3能否像其他外周激素一样通过受体介导的转运穿过血脑屏障进入大脑尚不清楚。

3 RFRP-3参与生殖应激反应

长期高度的焦虑和心理压力可能会导致女性生育能力受损。即使在应激源消失后，女性生殖功能受损的负面影响也不能完全恢复，目前还缺乏一个分子框架来理解压力等应激反应对女性生殖的长期影响。

应激抑制促性腺激素的释放已经在鱼、鸟、啮齿动物、家畜和人类中被证实。这主要是通过抑制GnRH和GnRH受体的合成，干扰垂体LH的释放，以及增强GnIH/RFRP-3神经元的功能来发挥作用[27]。小鼠和大鼠的束缚应激导致下丘脑RFRP-3表达增加，并伴随循环皮质酮水平的升高和HPO轴功能的降低；而下调下丘脑RFRP-3基因表达可以防止慢性应激导致的不孕和早期妊娠丢失，增加妊娠率和产仔数[28]。以上均说明RFRP-3参与了应激诱导的生殖效应整合。

Geraghty等[29]探讨了压力应激导致雌性大鼠出现持久生育问题的机制，每天限制大鼠活动3 h，共持续18 d，然后让大鼠恢复一个完整的生殖周期，结果发现大鼠的激素水平恢复到正常，但大脑中的RFRP-3水平仍然很高，并且在生殖周期恢复之后，也不太可能交配；即使出现交配，雌性大鼠怀孕概率也降低[限制活动大鼠的繁殖成功率（仅21%）显著低于非应激大鼠（76%）]。该研究进一步利用巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的病毒载体沉默雌性大鼠的RFRP-3表达，降低RFRP-3蛋白水平，结果显示雌性大鼠的交配、怀孕和胚胎存活率恢复到与非应激大鼠相似的正常水平。以上结果提示，应激期间RFRP-3水平的升高可能会对生育产生持久的负面影响。

另外，研究推测应激诱导的RFRP-3升高可能作用于影响交配和怀孕的神经回路，而不依赖于性激素[30]。注射RFRP-3可导致仓鼠大脑中与性冲动有关区域的细胞激活，包括视前内侧核、内侧杏仁核和终纹床核等所有接受RFRP-3投射的区域，这些效应独立于性腺类固醇和Kisspeptin细胞激活。

4 结语与展望

基于RFRP-3的重要神经内分泌作用及不同物种研究结果的差异性，在今后研究中，以下几个方面值得考虑。①RFRP-3在神经内分泌作用过程中的性别差异。虽然大脑内RFRP-3神经元形态及分布的性别差异尚不明显，但RFRP-3及其受体GPR147似乎在性别之间经历了不同的发育变化，在参与女性动情、哺乳、月经周期和妊娠等众多过程的调节机制可能与男性不同[31]。②E2负反馈对RFRP-3神经元作用的争议。类似于Kisspeptin神经元，RFRP-3神经元可能是E2反馈的中枢位点。然而，在不同物种、性别和条件下得到的结果是相互矛盾的。有研究显示E2处理可增加大鼠下丘脑细胞系中RFRP-3的合成[32]，另有研究显示E2处理降低了雄性和雌性小鼠RFRP-3神经元胞体内RFRP-3 mRNA的表达水平[31]。对雌性大鼠及雌性叙利亚仓鼠的研究表明，性腺切除后无论是否采用性激素替代对RFRP-3的合成都没有显著影响[33]。推测可能原因为：当基础E2浓度较低时，E2可能会在青春期前刺激RFRP-3 mRNA表达；而当基础E2浓度较高时，E2可能会抑制成体发情期RFRP-3 mRNA的表达。总之，RFRP-3的表达可能受E2的调节，但不同物种在E2调节RFRP-3的方式上可能存在差异，需要更多研究进一步阐明。③RFRP-3调节类固醇激素合成。已经证明，RFRP-3参与哺乳动物性腺类固醇生成的调节。然而RFRP-3调节类固醇激素合成的研究很少，其分子机制不清，深入研究神经肽对神经类固醇合成的调节，可能会极大地影响HPO轴的概念以及类固醇激素对下丘脑和垂体的反馈机制。

关于RFRP-3的研究应当围绕将基础研究向医学临床应用的转化开展，例如RFRP-3或其拮抗剂可以作为替代或辅助治疗药物来治疗应激、厌食和肥胖。RFRP-3作为促性腺激素分泌的内源性抑制剂，显示出其在治疗卵巢疾病、神经性生殖功能障碍相关疾病及性早熟、子宫内膜异位症等类固醇激素依赖性疾病方面的潜力。