高压均质对大豆蛋白乳液性质影响的研究进展

孙冰玉，郭汝杞，刘琳琳，黄雨洋，吕铭守，高 远，朱秀清

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

大豆蛋白作为营养剂、乳化剂和调节剂被广泛应用于动物饲料、日用化工、皮革造纸和纺织品等领域，作为食品辅料也在肉制品、乳制品、焙烤食品、保健品、糖果和冷饮等食品加工中发挥关键作用[1-2]。按照在离心机中的沉降系数，大豆蛋白可分为2S、7S、11S和15S球蛋白四个组分。其中7S与11S球蛋白含量较多，且与大豆蛋白的功能特性密切相关，当7S与11S比值增加时，大豆蛋白的乳化性、凝胶性和起泡性都随之增加[3]。大豆蛋白的发泡性能、乳化性能、凝胶性能、保水性、亲油性、粘性等理化特性和功能特性对现代食品研发十分重要[4]。由于其良好的双亲性和乳化性，也被用作乳化剂应用在食品乳液体系中。近年来，大豆蛋白乳液成为研究热点，通过改变外部环境条件，改变蛋白质的结构和聚集程度从而来改善蛋白质乳液的功能特性，常用物理改性技术有微波、超声波、超高压等[5-8]。

高压均质（High pressure homogenization，HPH）是一种非热加工且可调节压力来进行均质的应用技术[9-10]。根据高压均质机的均质腔结构不同，可分为穴蚀喷嘴型，碰撞阀体型和Y形交互型。高压均质技术是一种高效简洁的物理处理方法，在促进蛋白乳液应用于医药和食品领域方面具有巨大的潜在优势[11-13]。当蛋白乳液流经高压均质机的均质阀时，强烈的剪切、空化和湍流效应将乳液的液滴破碎，通过降低液滴的粒径来提高乳液的稳定性[14-15]。高压均质技术联合微胶囊化可以开发新型海洋资源功能性食品，合适的均质压力可获得较小的乳状液分层指数和最大的微胶囊化效率和氧化稳定性[16-17]。也有研究表明，高压均质处理可以提高大豆蛋白乳液的凝胶性能，通过改变大豆蛋白分子间的相互作用力，使得形成的网状凝胶结构更加稳定，从而拓宽了其在食品加工中的应用[18-20]。经过高压均质处理之后，物料的粒径会大大减小，从而改善其流变性质和界面性质，但过高的均质压力和均质次数可能会起到相反作用[13]。此外，高压均质处理还可以使食品系统中腐败和病原微生物失活[21]。

近年来，许多学者对高压均质处理技术在大豆蛋白乳液中的应用进行了研究，扩展了高压均质处理技术在食品工业中的应用领域。本文对高压均质处理对大豆蛋白乳液结构以及对其功能特性的影响展开了综述，以期为大豆蛋白稳定型乳液在食品中应用提供一定的理论依据。

1 高压均质大豆蛋白乳液的制备

1.1 高压均质制备大豆蛋白乳液的条件

高压均质制备大豆蛋白乳液是由外界输入能量，使物料发生物理、化学、结构等一系列性能变化，最终达到乳化的目的。高压均质机主要由传动系统、柱塞泵、均质阀三部分组成，由柱塞泵反复运动产生的吸力将物料吸入均质腔中，通过均质阀调节改变压力来制备大豆蛋白乳液。高压均质机内部的均质阀能产生强烈的湍流、空化和剪切效应，引起蛋白质粒径和构象变化，从而改善乳化性能，优点是加工时间短、成本低、效率高、营养损失少[22]。大豆蛋白乳液是属于水包油乳液体系，溶液中的连续相和分散相在高压均质下进行超微粉碎和乳化，形成复杂的稳定乳液体系，但是易受到外界条件的变化而变化[23]。高压均质处理制备大豆蛋白乳液的条件如表1所示。乳液的形成还与其组成、界面性质、各组分分子的空间构象及组分间的分子交互作用等因素息息相关[24-25]。因此，大豆蛋白与不同的分散相进行均质乳化，需要考虑到均质压力、均质次数与大豆蛋白乳液稳定性之间的相关性。

表 1 高压均质制备大豆蛋白乳液的条件Table 1 Conditions for preparing soybean protein emulsion by high pressure homogenization

1.2 不同均质条件对大豆蛋白乳液的影响

影响高压均质处理大豆蛋白乳液的主要因素有均质压力和均质次数，作为高压均质机主要的可控参数，在均质过程中显著影响大豆蛋白乳液的结构和性能。通常情况下，纳米乳液液滴的尺寸大小随均质压力、次数的增加呈显著下降趋势，且在一定均质压力及均质次数范围内，粒径的变化趋于稳定；但当均质压力过高和均质次数过多时反而使乳液的液滴聚凝，粒径分布增大[32]，具体过程如图1所示。适合的压力下，大豆蛋白的部分解折叠，提高乳液物理稳定性；在较高的压力下，物理稳定性则会下降，这可能是由于高压过高在出口阀处产生高温导致蛋白变性。此外，水相或油相的比例和蛋白浓度的不同，均质后的乳液性质也有明显差异。Hu等[15]利用高压均质制备不同浓度的大豆蛋白纳米乳液时发现界面蛋白浓度随着大豆分离蛋白浓度的增加呈先升高后降低的趋势。较高的界面蛋白浓度有利于更稳定乳液的形成，这是由于低浓度下，到达界面的单个蛋白分子可以不受周围任何分子的阻碍而展开。浓度过高也不利于乳液的形成，过高的蛋白浓度会使吸附层中的这些相邻分子通过油水界面的空间位阻和静电斥力限制后续的展开，从而降低了界面层蛋白质的展开速率。Li等[33]通过响应面优化试验也证实了高压均质压力100 MPa时，大豆分离蛋白的添加量1.5%，大豆磷脂酰胆碱添加量0.22%时制得的纳米乳的粒径和PDI最小，此时乳液的稳定性指数最高（Turbiscan stability index，TSI）。另外，选择适宜的乳化剂也可提高均质乳液的稳定性[34-35]。大豆蛋白乳液中常用到的乳化剂有吐温和卵磷脂等[36-37]，乳化剂的加入能够改善乳液中各种构成相之间的表面张力，使之形成均匀稳定的分散体系，乳液的粒径和微观形态呈减小趋势[38]。此外，大豆蛋白也可与脂肪、多糖等天然聚合物结合，通过静电相互作用或疏水相互作用形成非共价或共价复合物，提高复合体系乳化稳定性[39-40]。综上，调控及选择适当高压均质制备参数和水油相浓度以及添加合适的乳化剂对纳米乳液稳定性及功能具有显著的影响及重要意义。

2 高压均质对大豆蛋白乳液结构的影响

2.1 高压均质对大豆蛋白乳液中蛋白分子结构的影响

乳液的粒径和ζ-电位取决于包裹在油滴表面的蛋白质，是影响乳液理化性质的重要指标之一[41]。乳液聚集主要受界面层吸引力和排斥力的影响，增加乳液液滴之间的静电斥力可以提高乳液防止聚集的能力[42]。乳液的ζ-电位值越大说明乳液体系越稳定，纳米乳液粒径减小也可以显著提升纳米乳液的稳定性[43]。高压均质处理可以降低大豆蛋白乳液的粒径，ζ-电位值也显著提高。刘鹏等[44]研究发现高压均质处理的大豆蛋白乳液在150 MPa时乳液粒径最小，ζ-电位在120 MPa时最大。说明乳液体系的ζ-电位值增大的主要原因是蛋白质分子在高压均质下发生了重新排列[45]。高压均质过程中，高速剪切使得蛋白分子之间发生剧烈碰撞，蛋白表面暴露出更多的负电荷，增加了液滴之间的静电斥力，使得乳液不易凝聚或絮凝，乳液的稳定性增强[46]。但是，均质压力过高或均质次数过多，均质化过程中提供的过大能量又会导致新形成的液滴快速重新聚集而出现“过度加工”的现象。在此情况下，蛋白分子在高压下发生絮凝沉淀，乳液液滴的粒径增大和ζ-电位减少[47]。Li等[33]在制备大豆分离蛋白-磷脂酰胆碱纳米乳液时，发现均质压力为100 MPa、均质次数为4次时，颗粒粒径最小，ζ-电位值最高，纳米乳液的状态最稳定；而当均质压力和次数增加后，蛋白质表面电荷减少和蛋白聚集体增加，使得粒径增大。吴长玲等[26]的研究也证明了这一点，即过多的均质次数和过高的压力下，乳液粒径会有增大趋势，这是由于亚基结构相互聚集形成了难溶的聚集体，此时ζ-电位值也明显减小，这表明乳液的稳定性下降[48]。综上所述，合适的均质压力处理能够降低大豆蛋白乳液的粒径，ζ-电位值升高，大豆蛋白乳液的稳定性显著提高。

2.2 高压均质对大豆蛋白乳液中蛋白空间结构的影响

高压均质对大豆蛋白结构的影响包括蛋白质的二级、三级和四级结构，并不影响蛋白质的氨基酸序列[49]。α-螺旋是蛋白质分子中最丰富、最稳定的结构，并且在等电点时的含量最高，此时的β-折叠、β-转角和无规卷曲含量最低[50]。研究表明，α-螺旋的存在不利于改变大豆分离蛋白的结构，β-折叠、β-转角和无规卷曲结构的存在有利于增加大豆分离蛋白的灵活性[51]。Chen等[29]比较了高压均质处理前后的大豆蛋白乳液，结果表明，随着均质压力的增加，大豆蛋白乳液β-折叠和β-转角的含量逐渐增加，无规卷曲也有增加的趋势，α-螺旋结构呈减少趋势。高压均质处理可使大豆蛋白分子的空间结构展开，增强了大豆蛋白分子的灵活性，从而提高了乳状液液滴在油水界面的蛋白浓度，使其更加稳定而不易絮凝沉降。Zhu等[27]研究也证明了高压均质引起的无规卷曲结构的增加与蛋白质结构柔性的增加有关，这可以确定乳化性质和结构之间的关系，即结构变化导致蛋白质在界面上的快速重排，从而决定了乳化性能的变化。高压均质化处理不仅对二级结构产生影响，而且影响分子间的相互作用[52]。β-折叠主要靠分子间氢键维持，高压均质后其含量减少的原因可能是肽链上邻近氨基酸的羰基和酰胺基之间的氢键作用力被减弱或破坏。β-转角含量的降低与均质作用下暴露的疏水基团有关，导致蛋白质的表面疏水性增强[53]。二硫键是维持蛋白质三级结构的主要作用力，郭增旺等[54]报道了大豆蛋白乳液二硫键的含量随均质压力的增大先升高后降低，其原因是低压力处理可以促进二硫键的形成，促进交联反应和聚集体的形成，而高压力处理下会使聚集体自身的二硫键发生断裂。综上，高压均质处理后，蛋白质分子的柔性增大，空间结构更易延伸，此时乳化活性更高。

2.3 高压均质对大豆蛋白乳液中蛋白结构的影响机理

高压均质技术作为一种新型加工技术，主要是通过均质阀出口处出现的不同现象来降低大豆蛋白乳液的粒径并改变蛋白结构[55-56]。乳液粒径的减小提高了乳液的分散性，蛋白的溶解度显著升高，同时修饰蛋白质结构，这些修饰机制主要由于高压处理引起了蛋白质分子的三级和四级构象的变化[57-58]。如图2所示，大豆蛋白经过高压均质处理之后，蛋白质内部疏水基团在解折叠步骤时会暴露在分子表面，从而提高表面疏水性，同时疏水基团紧紧连接着大豆蛋白和油滴，提高了乳液体系的稳定性，但压力过高则会发生蛋白聚集沉淀的现象。另外，空间结构的改变也会影响大豆蛋白的功能特性，均质处理能够暴露内部的巯基基团，其表面疏水性增强，较高的表面疏水性值也可能是乳液的乳化性高的原因[59-60]。大豆蛋白乳液液滴解离和展开，并通过疏水相互作用和二硫键形成初级液滴聚集体，体积减小且长期稳定性显著。疏水基团的增加、新的二硫键形成以及二级结构的修饰也可以进一步证实蛋白质的再聚集体的形成[61]。在一定范围内的均质压力越大，效果越好，颗粒尺寸也越小，乳液液滴分布更均匀，稳定性高。此外还发现随着均质压力的增加，还可能造成乳液液滴间的再凝聚，从而造成乳液微滴尺寸增大导致蛋白变性而发生絮凝沉淀[62-63]。这与Kang等[64]在≤100 MPa的均质压力下得到的乳液液滴尺寸减小、稳定性升高，但＞100 MPa时液滴尺寸增加、稳定性降低表达的结果一致。

图 2 高压均质处理对大豆蛋白乳液蛋白空间结构的影响Fig.2 Effects of high pressure homogenization on protein spatial structure of soy protein emulsion

3 高压均质对大豆蛋白乳液特性的影响

3.1 高压均质对大豆蛋白乳液乳化性能的影响

乳化性是衡量大豆蛋白乳液性能的重要指标之一，稳定性则取决于物质内部的自由能减少和膜的界面性质，可以通过乳化稳定性、界面蛋白吸附量和脂肪氧化稳定性来体现。

3.1.1 高压均质对大豆蛋白乳液乳化性与乳化稳定性的影响 蛋白质的乳化性能由乳化活性（Emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（Emulsion stability index，ESI）来表示，前者测定蛋白质在界面上的吸附能力，后者则评价所形成的吸附层的性质，较高的EAI值表明单位质量的蛋白质可以稳定较大的油水界面面积[65]。一般来说，蛋白溶解度与其乳化性成正相关，溶解度越大，乳化性越高[66]。而决定其乳化性能的是大豆蛋白的构象柔性，高压均质处理提高了大豆蛋白乳液的溶解度，这促进了蛋白质在油水界面的扩散，从而有助于乳化性能的改善[67]。经过高压均质处理后，大豆分离蛋白空间结构展开，暴露了分子内部原有的疏水基团，增强了蛋白的亲脂性，从而提高了大豆分离蛋白在油水界面上的吸附效率，宏观性能就是蛋白质乳化能力的提高[68]。同时，高压均质处理也增大了大豆蛋白多肽的展开程度，从而提高界面蛋白的表面积来改善大豆蛋白乳液的乳化性能[69]。在一定压力范围内，大豆蛋白乳化活性会随均质压力的增加而有明显提高，一旦超过此范围，乳化性能则会下降[37]。

3.1.2 高压均质对大豆蛋白乳液界面蛋白吸附量的影响 界面蛋白含量也是衡量乳液稳定性的一个重要指标，一般来说，界面蛋白吸附量与蛋白吸附在油水界面的多少成正比[70]。当大豆蛋白乳液通过均质阀时，会使液滴破裂，缩短蛋白质吸附在界面膜的平衡时间，增加了乳液的表面疏水性，使界面蛋白的吸附能力增强[71]。高压均质处理促使更多的大豆蛋白吸附在油水界面膜上，赋予大豆蛋白乳液良好的抗聚结稳定性[72]，这与Zhou等[73]的研究结果一致。此外，乳液的稳定性也与乳液颗粒的高界面蛋白吸附量和界面膜的形成密切相关[74-75]。刘竞男等[76]研究发现，120 MPa的压力下均质大豆蛋白乳液，随着均质次数的增加，界面蛋白吸附量有所降低，可能是由于界面膜达到了最大吸附量，蛋白之间的相互作用抑制了蛋白分子的进一步吸附。大豆蛋白之间的疏水相互作用有助于维持乳液的稳定性，随着均质压力的升高，大豆蛋白乳液的溶解度增加，在连续相中观察到更多的蛋白质聚集物和蛋白质聚集团簇。当聚集物更多时，则需要更多的蛋白质来获得界面的全覆盖[67]。越稳定的乳状液在界面处的蛋白质含量越高，适合的均质压力和均质次数能够提高大豆蛋白的乳化稳定性。

3.1.3 高压均质对大豆蛋白乳液氧化稳定性的影响

当乳液的比表面积较高时，乳液体系的热力学性质很不稳定，容易发生脂质氧化[77]。乳液的脂质氧化强烈依赖于油相体积分数和油滴上的蛋白质附着量，更稳定的乳液在界面上表现出更高的蛋白质含量。与常规均质处理方式相比，经过高压均质处理后乳液的颗粒尺寸较小，此时更多的蛋白会吸附在油-水界面，并通过在水、油两相之间形成空间位阻来维持乳液稳定[75]。另外，对于蛋白质乳液，蛋白质可通过与油相直接接触形成较厚的粘弹性界面膜来提高乳液的氧化稳定性[78]，这使得该蛋白具有抗氧化能力，压力越高，油滴越小，乳液的抗氧化效率越高。高压均质技术适用于生产的大豆蛋白乳液是相对稳定的亚微乳液，与常规方式获得的乳液相比，具有高的物理稳定性[79]。Hebishy等[80]研究表明经过高压均质处理的蛋白乳液，显示出了良好的抗脂质氧化能力。但是在过高压力下，抗脂质氧化能力会有所下降。Chen等[29]的研究结果也得到当均质压力大于120 MPa时，乳化液的氧化稳定性会受到影响。这是由于经高压均质处理的大豆蛋白乳状液液滴过小，比表面积大，使暴露在油水界面的比表面积也增大，加速了脂质的氧化速率。另外，高压导致大豆蛋白过度加工，大豆蛋白变性不能发挥其稳定作用，使大豆蛋白的乳化性能下降，从而降低了其保护油滴不被氧化的能力，Fernandez-Ávila等[30]的研究也证实了这一点。此外，影响高压均质处理大豆蛋白乳液脂质氧化的许多其他因素的争论仍在继续，例如乳液的物理结构、乳化剂数量和类型等。利用高压均质技术制备蛋白乳液时，添加抗氧化剂可达到抑制脂质氧化的目的。

3.2 高压均质对大豆蛋白乳液流变性能的影响

大豆蛋白乳液的流变特性可用动态流变学或静态流变学两种不同模式来反映，前者测量结果可以反映其结构特性，后者来描述流动特性、粘度特性等[81]。乳液的粘度很大程度上受蛋白质组分的流体力学性质的影响，例如相对分子质量、粒径及分子形状等，其中蛋白质分子的大小、形状是影响乳液粘度的重要因素。随着剪切速率的变化，表观粘度的测量也可用于提供关于蛋白质-蛋白质相互作用强度的信息[67]。Chen等[29]研究发现在相同剪切速率下，大豆蛋白乳状液的表观粘度随均质压力的增加而增加，在120 MPa时达到最大值，这与液滴相互作用的增加有关[35]。随着剪切速率的增加，蛋白质结构逐渐展开，暴露出分子内部的疏水基团，从而使分子间作用力提高[82]。而且根据Stokes定律，液滴的沉降速度与粘度成反比，即乳液粘度越大，液滴在分散相中的速度越慢，形成的乳液就越稳定[83]，这与吴长玲等[26]的研究结果一致。

此外，高压均质处理后大豆蛋白乳液的储能模量显著增大，且随着均质压力的增加，G’和G”也随之增大。乳液流变特性中的储性模量（G’）代表抵抗其变形的力，所以分子间力越大，阻力越大，G’越大，相反损失的能量越多，损耗模量（G”）越大。这表明大豆分离蛋白分子之间存在显著的界面相互作用，蛋白质分子的流动性随高压的增加而增加[84]。高压均质处理作用也可增强蛋白质的去折叠，使蛋白质分子间的相互作用位点暴露增多，提高了其吸附在油-水界面上的能力，进而形成更稳定的网络结构。刘竞男等[76]研究发现高压均质处理后大豆分离蛋白乳液的G’和G’’都升高，且G’大于G’’，表现出明显的弹性行为，这意味着在不同均质压力下制备的大豆蛋白乳液的弹性特性是粘性的主导。Fernández-ávila等[68]的研究结果也证明了这一点，即高压均质能够破坏大豆蛋白的立体网络结构中二硫键的共价交联，同时加速了蛋白质基团的膨胀，从而促进了非极性区域间疏水基团的相互作用[85]。同时降低了混合乳液体系中分散相油滴的体积，增加了油水界面接触面积。综上，高压均质可以扩大液滴与液滴、液滴与基质之间的相互作用，从而形成更加致密的网络结构，使粘弹性性能增大[86]。

3.3 高压均质处理对大豆蛋白乳液凝胶性能的影响

大豆蛋白的功能特性如凝胶性能等在食品的加工和贮藏过程中起着重要作用[87]。高压均质产生的高剪切作用，破坏大豆蛋白分子的非共价键，蛋白结构进一步展开，从而导致一些反应基团（游离巯基和疏水基团）暴露。在热凝胶过程中，游离巯基氧化形成二硫键，影响凝胶的网络结构和稳定性[88-89]。Bi等[11]利用共聚焦激光扫描显微观察到的高压均质处理下大豆分离蛋白乳液凝胶的微观图像，与天然的大豆蛋白相比表现的更加均匀，随着压力的升高，蛋白质聚集物（白色区域）的大小逐渐减小。这说明疏水基团暴露可以使体系更加稳定，从而加速了蛋白乳液的凝胶化和促进更稳定网络结构的形成[79]。高压均质形成稳定的乳液凝胶网络也可以锁住更多的水，因此持水能力显著提高。Kang等[64]研究表明大豆球蛋白乳液的凝胶强度和持水力随着均质压力的提高而升高，这是由于在高压均质处理过程中，溶解度和表面疏水性的提高，导致大豆球蛋白倾向于向空气-水界面延伸，降低了界面张力，经过热诱导蛋白变性形成了更加致密的凝胶结构。龙小涛等[90]和王革新等[91]的研究也证实了这一点，即高压均质会引起大豆蛋白的疏水基团露，形成的凝胶硬度远远大于未处理的大豆蛋白乳液，此外适当增加油相的体积分数也能缩短凝胶化的时间[92-93]。一般来说，乳液的稳定性越好，其凝胶强度就越好[94]。在较高的压力下，乳液倾向于形成更稳定的各向同性网络凝胶结构。

4 结论与展望

大豆蛋白乳液不仅可以应用在餐桌食品中，还可以应用到日常保健中，如大豆蛋白乳状液凝胶可以替代食品生产中对人体健康有害的饱和脂肪酸，也可以预防如心脑血管和冠心病等疾病。随着对大豆蛋白乳液制备方法和性质研究的不断深入，大豆蛋白乳液的应用前景越来越广泛。面对全球对高质量蛋白质的需求，采用高压均质技术对大豆蛋白乳液进行改性是非常必要的，可以大大提高大豆蛋白乳液的商业价值。本文综述了高压均质处理大豆蛋白乳液的过程及均质条件对其形成的影响，阐明了高压均质处理大豆蛋白乳液结构和特性的机制研究。大豆蛋白乳液经高压均质处理后，乳液液滴粒径减小，表面活性增强，溶解度升高，增加了液滴之间的静电斥力，使得乳液不易凝聚或絮凝，增加了蛋白乳液稳定性。随着压力的升高，蛋白的空间结构进一步展开，伴随着亚基的部分解折叠和反应位点的暴露。这些暴露的基团有助于分子间的相互作用，从而显著提升其乳化、流变、凝胶等功能特性，拓宽了大豆蛋白乳液在食品中的加工特性。目前已有较多关于高压均质技术改善大豆蛋白乳液功能特性的研究，但大都停留在乳液的稳定性、凝胶性等方面，而对大豆蛋白乳液中各组分的研究尚少。因此，可以加强高压均质处理对大豆7S球蛋白乳液和大豆11S球蛋白乳液的研究，开发出具有独特功能特性的大豆蛋白乳液。