水稻秸秆、麦麸、葡萄糖添加对绿狐尾藻青贮质量影响研究

曹 欣， 吴康乐， 文乐元， 黄丽娟， 肖润林， 张志飞*

(1.湖南农业大学农学院， 湖南 长沙 410128； 2.湖南省畜牧水产事务中心， 湖南 长沙 410006； 3.中国科学院亚热带农业生态研究所， 湖南 长沙 410125)

绿狐尾藻(MyriophyllumelatinoidesGaudich)属小二仙草科多年生沉水或浮水草本植物，能有效吸附氮、磷等水体富营养元素，广泛应用于污染水体的生态修复[1,2]，其在富营养化水体中生长速度快，多次收割条件下其收获的生物量(干重)高达 5.34～13.42 g·m-2·d-1，且营养价值较高[3-4]。生长旺盛期大规模刈割后的绿狐尾藻可开发为非常规饲料资源[5-7]。但绿狐尾藻含水量高，调制干草需要大量能耗；与干物质含量高的秸秆、农副产品等进行混合青贮是经济高效的加工方式[8]。绿狐尾藻与水稻秸秆混合青贮，既可以平衡青贮原料含水量满足乳酸菌繁殖需求，提高青贮成功率，还可以实现秸秆资源的有效利用[9]。水稻秸秆资源丰富，成本低廉，但营养价值低，纤维含量高，过量添加会降低青贮的青贮品质和营养价值[10]。玉米粉、麦麸等农副产品可溶性碳水化合物含量高，常作为青贮吸附型添加剂[11]，但价格较高，添加比例高会导致混合青贮成本增高。此外，混合青贮常添加葡萄糖作为发酵底物，以满足乳酸菌大量繁殖需求，迅速启动发酵，提高发酵品质。孙茜等[12]研究表明乳酸菌菌剂搭配葡萄糖有利于绿狐尾藻青贮过程中乳酸菌的快速繁殖。但目前，利用吸附剂、青贮添加剂制备经济、高效的绿狐尾藻混合青贮体系的研究尚较少。本研究以不同混合比例的水稻秸秆和麦麸分别与70%左右绿狐尾藻为原料，分别添加植物乳杆菌和0，2%，4%和6%的葡萄糖进行混合青贮，测定其青贮品质及有氧稳定性，旨在利用水稻秸秆和少量葡萄糖替代麦麸提升绿狐尾藻混合青贮饲料质量，探讨狐尾藻混合青贮体系中适宜添加的水稻秸秆、麦麸比例及葡萄糖的比例，为狐尾藻混合青贮加工技术的完善提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮材料为湖南金井中国科学院农业环境监测站(28°55′36″N，113°34′65″E)三级净化系统的绿狐尾藻，在2019年8月4号刈割水上部分并粉碎至1～2 cm。水稻秸秆为当年收获的稻草粉碎后备用，麦麸来自五得利面粉集团有限公司，植物乳杆菌(台湾亚芯有限公司，菌含量为1×1011cfu·g-1，添加量为1×106cfu·g-1FM)，葡萄糖(国药有限公司)。绿狐尾藻、麦麸和水稻秸秆化学成分如表1所示。

表1 绿狐尾藻、麦麸和水稻秸秆化学成分Table 1 The chemical composition of Myriophyllum elatinoides,rice straw and wheat bran 单位：% DM

1.2 试验设计

试验前一天测定新鲜绿狐尾藻、水稻秸秆、麦麸等原料含水量，以混合后青贮原料理论含水量为65%为前提，计算分别添加水稻秸秆0%，5%，10%，15%所相应的麦麸的添加量和新鲜绿狐尾藻的添加量。

采用双因素完全随机设计，A因素为水稻秸秆添加比例：0%，5%，10%，15%；B因素为葡萄糖添加比例：0%，2%，4%，6%(以混合青贮原料总质量为基础)。植物乳杆菌每组固定添加，添加量1×106cfu·g-1FM。共有16个处理组，每个处理组设4个重复，处理方式如表2所示。

表2 试验设计分组Table 2 Experimental grouping

按照配比将绿狐尾藻、水稻秸秆、麦麸充分混合，喷洒植物乳杆菌，添加一定比例葡萄糖，再次充分混合，使用聚乙烯真空青贮饲料袋(长40 cm，宽28 cm，厚度0.02 mm)模拟裹包，每袋青贮包约500 g，放入室温青贮后开包取样进行各项指标分析。

1.3 测定项目及方法

1.3.1感官品质测定 开包后首先进行青贮饲料感官鉴定，根据德国农业协会评分法，根据气味、结构和色泽进行评估并计分，按照得分评定为优、良、中、下4个等级[13]。

1.3.2发酵品质测定 每重复四分法取20 g青贮鲜料装入250 mL锥形瓶，加入180 mL去离子水，用榨汁机(九阳JYL-C012型多功能搅拌机)将其榨碎，先后用4层纱布过滤，得到青贮饲料浸提液，用于pH值、氨氮(NH3-N)、乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propanoic acid，PA)、丁酸(Butyric acid，BA)的测定，各指标3次重复。

pH值采用Spectrum公司SI400型pH计测定；采用Agilent 1260高效液相色谱仪测定乳酸的含量[14][色谱柱：AcclaimTMOrganic acid(4.00 mm×150 mm，5 um)；进样体积：5 uL；流速：0.6 mL·min-1；柱温：30℃；流动相：50 mM磷酸二氢钠溶液，运行时间：10 min；检测波长210 nm)；乙酸、丙酸、丁酸含量采用气相色谱仪Agilent 7890A测定(色谱柱：DB-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25 um)；流速：0.8 mL·min-1；进样量：1 uL；分流比：50∶1；程序升温条件：60℃，保持2 min，以20℃升至220℃，保持3.5 min；检测器：氢火焰离子化检测器，温度：250℃]。氨氮测定方法参照T/CAAA 003-2018中的苯酚-次氯酸钠比色法[15]。

参照日本草地畜产协会制定的青贮饲料发酵品质V-Score评分标准[16]，以鲜样(Fresh weight，FW)中氨氮/总氮、乙酸、丙酸及丁酸含量计算评分值。

1.3.3营养品质测定 四分法从青贮包中取200 g样品，105℃烘箱中15 min杀青，然后调至65℃烘干到恒重，测定干物质(Dry matter，DM)等指标。凯氏定氮法测粗蛋白(Crude protein，CP)[17]，酸碱消煮法测粗纤维(Crude fiber，CF)[17]，范氏法测中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)[17]，蒽酮比色法测可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)[18]。各指标3次重复。

1.3.4有氧稳定性分析 青贮包打开后，将每处理剩余的青贮饲料充分混匀后，把约200 g的青贮料放入2.5 L小塑料桶中，将MDL-1048A高精度温度记录仪的传感器插入青贮料中，用纱布将桶口盖住，防止交叉污染和减少水分损失，然后将传感器接线有序插入记录仪上，每30 min自动记录一次温度变化情况，每处理3次重复，当温度比外界温度高出2℃时结束试验，记录有氧稳定性时长(Aerobic stability，AS)。室温为空白对照。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2010软件进行初步整理，试验结果以平均值表示，用DPS数据处理系统软件进行统计分析。各测定数据进行双因素方差分析(Two-way ANOVA)；处理组间进行LSD法多重比较(P<0.05)；水稻秸秆和葡萄糖添加比例和发酵品质、营养指标和有氧稳定性进行皮尔逊线性相关性分析。

根据公式计算原料成本：

混合青贮成本(元)=原料A所占混合原料比例×原料A成本价+原料B所占混合原料比例×原料B成本价+原料C所占混合原料比例×原料C成本价。

麦麸2 000 元·t-1、水稻秸秆600 元·t-1(www.cnhnb.com惠农网数据)；绿狐尾藻鲜草人工打捞成本100 元·t-1；葡萄糖价格3 800 元·t-1(www.1688.com阿里巴巴数据)。

依据田凤调[19]提出的秩和比法(Rank-sum ratio，RSR)对不同处理绿狐尾藻混合青贮的综合效果进行评价，对高优指标和低优指标分别降序、升序排序，并计算RSR，取值越小表明综合评价越好。RSR计算公式如下：

式中，指标j= 1,2,3,，m；组别I = 1,2,3，n；Rij为第i组第j个指标的秩。

2 结果与分析

2.1 混合青贮感官评定分析

对开包后的青贮进行感官评价，茎叶结构均保持良好，除Z0,Z2,Z4,Z6,F4和F6色泽略有变色外，其他组皆与原料相似，F0、T0和FT0丁酸味较重。F2,F4,F6,T2,T4和FT4感官评价等级为优秀，其他组皆为良好(表3)。

表3 绿狐尾藻混合青贮感官评定分析Table 3 Sensory evaluation analysis of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.2 葡萄糖和水稻秸秆添加对混合青贮发酵品质的影响

如表4所示，水稻秸秆添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用对混合青贮发酵品质的pH值、NH3-N/TN、LA、AA、PA和BA含量均有极显著影响(P<0.01)。以水稻秸秆添加比例为主效应分析表明，各处理BA含量随水稻秸秆添加比例增加而显著增加，存在显著正相关关系(P<0.05)；未添加水稻秸秆和添加15%水稻秸秆的混合青贮饲料pH、NH3-N/TN和乙酸显著低于其他2个处理组，所有处理组pH均在4.2以下，NH3-N/TN低于10%，属于优质青贮饲料的pH和NH3-N/TN范围。以葡萄糖添加比例为主效应分析表明，各处理pH值随葡萄糖添加比例增加而显著下降，存在显著负相关关系(P<0.05)；未添加葡萄糖的混合青贮饲料的NH3-N/TN、AA、PA和BA显著高于其他3个处理组，LA含量均显著低于其他3个处理组(P<0.05)；随着葡萄糖添加比例增加，混合青贮饲料的NH3-N/TN、AA、PA和BA含量有下降趋势，但无显著相关性。

表4 绿狐尾藻混合青贮发酵品质双因素方差分析Table 4 Two factor variance analysis of fermentation quality of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.3 葡萄糖和水稻秸秆添加对混合青贮营养品质和有氧稳定性的影响

如表5所示，水稻秸秆添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用对混合青贮营养品质的WSC、CP、NDF、ADF、CF含量和AS均有极显著影响(P<0.01)。以水稻秸秆添加比例为主效应分析，随着水稻秸秆添加比例的增加，各处理NDF、ADF、CF含量显著增加，存在极显著正相关关系(P<0.01)，CP含量显著下降，存在极显著负相关关系(P<0.01)；未添加水稻秸秆和添加15%水稻秸秆的混合青贮饲料WSC含量显著高于其他2个处理组(P<0.05)，未添加水稻秸秆和添加5%水稻秸秆的混合青贮饲料AS显著高于其他2个处理组(P<0.05)。以葡萄糖添加比例为主效应分析，随着葡萄糖添加比例增加，CP、NDF、ADF、CF含量和AS均显著降低，存在极显著负相关关系(P<0.01)，与WSC含量有极显著正相关关系(P<0.01)。

表5 绿狐尾藻混合青贮营养品质(%DM)和有氧稳定性(h)双因素方差分析Table 5 Two factor variance analysis of Nutrient quality (%DM) and aerobic stability (h) of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.4 混合青贮效果综合评价

水稻秸秆添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用对混合青贮的发酵品质、营养品质和有氧稳定性均有极显著影响(P<0.01)，说明水稻秸秆和葡萄糖两个因素不同水平同时作用对各指标均有显著的加强或减弱作用。鉴于此，将各处理看作单因素处理组(简单效应分析)，以感官评价等级、V-Score评分、LA/AA、CP含量和AS为高优指标，pH、NDF和ADF含量、原料成本为低优指标，排序后计算秩和比RSR值，进行综合评价(表6)。结果发现，不添加葡萄糖处理组的V-Score评分在62.42～78.39，pH 4.5～4.55，LA/AA比值均<1，发酵品质相对较差；其他处理组的V-Score评分均在80分以上，pH≤ 4.28，发酵品质较好。随水稻秸秆添加比例增加导致绿狐尾藻混合青贮饲料的CP、NDF和ADF含量随之改变；在相同混合青贮配方处理组中，CP含量随葡萄糖添加的增加而降低；葡萄糖添加比例对混合青贮饲料的NDF和ADF含量有一定影响，但无明显规律，交互作用效应明显。T4,FT4和T6的有氧稳定性较差(≤ 36 h)，Z6也较低(62 h)，其他处理组的有氧稳定性均≥132 h，可见较高含量的葡萄糖和较高比例的水稻秸秆对绿狐尾藻混合青贮饲料的有氧稳定性均有负面影响。

表6显示,单独添加2%～6%葡萄糖处理组的Z4,Z2,Z6,T4和F4青贮效果综合排名位居前5，可见不添加水稻秸秆而添加2%～6%葡萄糖的绿狐尾藻混合青贮饲料CP含量在13%以上，NDF含量低于25%，ADF含量低于14%，饲用品质和发酵品质均较好。添加5%或10%的水稻秸秆并添加4%的葡萄糖也可获得质量较好的青贮饲料，其中添加10%水稻秸秆的T4综合排名第四，原料成本最低。

表6 绿狐尾藻混合青贮品质秩和比排序Table 6 Rank sum ratio ranking of mixed silage quality of Myriophyllum elatinoides

3 讨论

3.1 绿狐尾藻青贮可行性分析

水生植物因附生乳酸菌含量低、含糖量低、含水量高等特点，青贮较陆生植物困难，但也不乏成功的经验。凤眼莲经过厌氧、控水、调酸、调糖四步骤后能调制出优质的青贮饲料，将其替代部分日粮饲喂肉用山羊有较好的生产性能[20]；芦苇和浮萍等[21-22]制作青贮饲料效果也较好。绿狐尾藻一般用于养殖场的污水处理，三级绿狐尾藻表面流人工湿地中第三层湿地生长的绿狐尾藻可达到饲用标准，无有害物质污染风险，符合饲料安全[5]，绿狐尾藻干粉在饲喂猪[6,23]、鸭[24]等畜禽方面也有较好的效果，是可开发的非常规饲料资源。新鲜的绿狐尾藻含水量较高(90%)，吴康乐等[9]研究发现70% 绿狐尾藻与15%水稻秸秆和15%玉米粉混合可制备发酵品质较好的青贮饲料，如再添加纤维素酶可进一步改善青贮饲料营养品质和有氧稳定性。本研究中以水稻秸秆和麦麸调节绿狐尾藻含水量进行青贮，感官评价等级均为良好以上；不添加水稻秸秆制备的绿狐尾藻麦麸混合青贮饲料发酵品质好，粗纤维含量较低，可考虑用于单胃家畜养殖；添加适当的葡萄糖和水稻秸秆可制备青贮品质较好的粗饲料，且与添加30%麦麸相比，使用10%水稻秸秆替代麦麸添加，可以降低原料成本；今后可根据不同畜禽的营养需求，筛选适宜的绿狐尾藻混合青贮配方，并可通过酶制剂、乳酸菌制剂等添加剂改善青贮品质，以便形成绿狐尾藻青贮标准化加工程序，从根本解决绿狐尾藻非常规饲料加工和利用问题。

3.2 葡萄糖、水稻秸秆与麦麸添加对混合青贮品质的影响

青贮pH值、V-score是衡量青贮发酵品质的重要指标，青贮饲料中pH≤4.2、V-score>80分时，青贮饲料发酵效果良好。本研究中未添加葡萄糖的4个处理组的pH值均>4.2，V-Score<80分，乳酸/乙酸比值<1，异型乳酸菌占主导地位[25]，从发酵品质来看属于中等；添加葡萄糖后显著改善了绿狐尾藻混合青贮发酵品质。黄梁木枝叶[26]和木薯叶[27]青贮中添加葡萄糖能降低青贮饲料pH值，木薯叶青贮中添加2%，4%的葡萄糖能显著提高LA含量和显著降低BA含量[27]，与本研究结果相似。本实验中各处理组原料中的可溶性糖含量均满足乳酸菌繁殖的最低含量(>6%)，但外源葡萄糖添加对发酵品质仍有显著影响；且葡萄糖添加比例对发酵品质各指标的作用效应大于水稻秸秆添加比例，这可能是因为乳酸菌繁殖速度与可溶性糖含量及种类有关，乳酸菌在低糖环境条件下较正长环境下的生存能力差，水生植物含糖量普遍较低，且所含可溶性糖的类型可能不易于乳酸菌利用[28]。直接添加葡萄糖为乳酸菌繁殖提供直接糖源，更快的促进无氧环境中乳酸的积累，降低pH，从而改善青贮发酵品质。值得注意的是本研究中葡萄糖添加量与AS有极显著负相关关系，这可能是葡萄糖添加比例增加促进了同型发酵，降低了AA含量，从而影响了有氧稳定性。

青贮过程中植物呼吸、微生物蛋白酶活动及微生物脱氨等作用会造成青贮饲料中CP等营养成分流失或者纤维成分变化[29]。桑叶[30]和四倍体刺槐[31]中添加葡萄糖，青贮料中CP，NDF和ADF含量下降。本研究中随着葡萄糖添加比例增加，CP，NDF，ADF和CF含量均极显著降低(P<0.01)。本研究中混合原料WSC含量可以满足调制优质青贮饲料所需6%～7%的要求，但是添加葡萄糖相较于未添加的青贮发酵品质好，乳酸/乙酸比值较高；但粗蛋白含量损失较多，这与常规青贮结果相悖。该现象原因可能与水生植物青贮过程中微生物菌群多样。有些酵母菌可分解蛋白质，在低于pH4的环境下，也能表现较强活性[32]，而限制酵母菌的主要因素为乙酸[33]，本试验中外源葡萄糖增多促进了同型乳酸菌发酵，但较低的乙酸含量可能无法完全抑制酵母菌的生长繁殖，多余的葡萄糖、乳酸等同时也为酵母等可降解氮化合物的微生物提供了繁殖底物，从而造成营养成分流失。因此，应加强绿狐尾藻附生乳酸菌种类特性、绿狐尾藻青贮发酵微生物菌群多样性等研究，以明确外源乳酸菌在绿狐尾藻青贮中的作用机理，为绿狐尾藻混合青贮发酵品质和营养品质调控提供理论依据。

4 结论

水稻秸秆与麦麸添加比例、葡萄糖添加比例以及二者互作对绿狐尾藻混合青贮饲料的发酵品质、营养品质以及有氧稳定性均有显著或极显著影响(P<0.05或P<0.01)。绿狐尾藻混合青贮体系中水稻秸秆添加比例增加降低了发酵品质和营养品质，葡萄糖添加比例增加会提高发酵品质、改善纤维品质，但也会降低青贮饲料中CP含量。综合来看，70%绿狐尾藻与30%麦麸混合青贮添加2%～6%的葡萄糖可制备发酵品质、营养品质和有氧稳定性性均优的青贮饲料；添加5%或10%的水稻秸秆并添加4%的葡萄糖也可制备成本更低、品质较好的青贮饲料。