‘晋农1号’达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的鉴定及特性研究

杨凯元， 黄 臣， 高 鹏， 梁银萍， 韩玲娟， 赵 祥

(山西农业大学草业学院, 山西 太谷 030801)

土壤中广泛分布的根瘤菌可以通过诱导植物根、茎皮层细胞增生形成具有固氮功能的共生体，将空气中游离态的氮还原成铵态氮，加速植物对氮素的吸收和利用[1]。其中，豆科植物和根瘤菌共生体的固氮量约占生物固氮总量的65%[2]，在提高产量、改善品质方面发挥重要作用[3]。根瘤菌固氮是一个高耗能过程，每还原一个N2分子需要消耗16分子三磷酸腺苷(ATP)[4]，因此固氮过程对磷元素的需求量大。磷缺乏不仅直接导致豆科植物生长受限，而且抑制了根瘤活性及其固氮能力，造成植物产量和品质的大幅降低[5-6]。研究表明，在低磷条件下，根瘤菌可以通过根瘤表面吸收周围土壤中的可溶性磷[7]，而土壤中95%以上的磷为难溶性磷[8]，不能被根瘤菌直接吸收利用。因此，一些兼具解磷能力的根瘤菌或者根瘤内生非结瘤解磷菌，通过构建复合菌群的方式在根瘤中共存，分解周围的难溶性磷供固氮菌使用[9-10]，从而促进结瘤，提高根瘤固氮能力。

目前，已从豆科植物根瘤中分离出许多非结瘤内生菌(Non-rhizobial endophytes,NRE)，如叶杆菌属Phyllobacterium、泛菌属Pantoea、芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas和农杆菌属Agrobacterium等[11]，证实不仅具有解磷、联合固氮的功能[12]，而且具有促生、防病等广泛的生物学作用[13-14]。与根际解磷菌不同，根瘤内生解磷菌能够为根瘤菌结瘤固氮提供磷[9]，目前已有研究通过根瘤菌和根瘤内生解磷菌双接种试验，进一步证实了大豆Glycinemax、鹰嘴豆Cicerarietinum等豆科植物的结瘤固氮能力显著增强，并促进根系生长，显著提高了作物的产量[15-17]。不同豆科植物与根瘤内生菌建立的共生体中，解磷菌的类型和解磷能力存在差异，赵龙飞等[14]从大豆根瘤内分离出7株解磷能力较强的内生菌，其中恶臭假单胞菌Pseudomonasputida的解磷量最高可达452 μg·mL-1；Rajput等[18]从绿豆Vignaradiata根瘤内分离出1株解木聚糖类芽胞杆菌Paenibacillusxylanilyticus，但解磷量较低，为134.48 μg·mL-1。因此，在豆科植物栽培过程中，挖掘和应用具有较强解磷能力的根瘤内生菌是促进植物结瘤固氮，增加产量，改善品质，保证农业绿色可持续发展的重要途径。

达乌里胡枝子是豆科(Leguminomase)胡枝子属(Lespedeza)的多年生植物，能与根瘤菌共生，是山西、陕西等黄土高原地区优良的乡土牧草和水土保持先锋植物[19]。目前，国内外有关胡枝子属植物根瘤内生菌的研究较多，如Palaniappan等[20]从韩国的胡枝子属植物根瘤中共分离出13个种共39株内生菌，其中24株具有解磷能力；Subramanian等[21]进一步将其中具有解磷能力的巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium与水稻Oryzasativa叶片内生菌微枝杆菌Methylobacteriumoryzae和大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicum共接种，发现大豆的结瘤固氮能力显著提升；Busby等[22]利用高通量测序对比了入侵物种截叶铁扫帚(Lespedezacuneata)与本地L.virginica、L.repens、L.procumbens、L.capitata、L.stuevei和L.violacea等6个胡枝子种的根瘤内生菌多样性，发现后者的种类更为丰富，其中伯克氏菌目Burkholderiales和肠杆菌科Enterobacteriaceae细菌为常见的解磷菌。可见，胡枝子属植物根瘤中存在具有解磷和共生固氮能力的内生菌，且种类与寄主生长的地理位置密切相关。然而，目前尚未见关于山西省种植的达乌里胡枝子根瘤内生菌，尤其是解磷菌的研究报道。本团队于2014年获得1个国家审定草新品种‘晋农1号’达乌里胡枝子，该品种适应性强、耐旱、耐贫瘠且品质优良，营养价值丰富，对于黄土高原地区生态修复以及饲草生产发挥着重要作用[23]。本文通过分离和鉴定‘晋农1号’达乌里胡枝子根瘤内生菌，筛选解磷菌并分析其抗逆和促生特性，以期为研发适合于黄土高原地区甚至退化盐碱地胡枝子建植的根瘤微生物复合菌剂提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1根瘤样品采集 2021年8月中旬，在山西省晋中市太谷区(112°35′25″E，37°26′1″N)的‘晋农1号’达乌里胡枝子种植田采集盛花期[24]的植株样品，种植田面积为0.3 ha，采用“五点取样法”在种植田设置5个5 m×5 m的重复小区，每个小区在对角线上每间隔5 m随机选取3株达乌里胡枝子，共采集15株。用75%乙醇表面消毒的铁铲挖取完整的根系土胚，抖落根系表面的土壤，挑选具有根瘤的植株带回室内。用灭菌剪刀剪取根瘤部位根系，置于75%酒精中消毒30 s，无菌蒸馏水漂洗3次，放入底部盛有干燥剂、中间用灭菌脱脂棉隔离的5 mL离心管中，置于4℃低温冰箱中保存，3 d内进行根瘤内生菌的分离。

1.1.2培养基 参考不同的文献方法配制：牛肉膏蛋白胨培养基、YMA(Yeast mannitol agar)培养基、PKO(Pikovaskaia's)无机磷培养基、蒙金娜有机磷培养基[14]，TY液体培养基[25]，淀粉琼脂培养基、明胶培养基、葡萄糖蛋白胨液体培养基、1%胰胨水溶液[26]，CAS(Chrome azurol S)铁载体检测培养基[27]，葡萄糖蛋白胨培养基[28]。

培养基均于121℃高温高压灭菌20 min，其中明胶培养基、葡萄糖蛋白胨液体培养基、1%胰胨水溶液分装于试管，TY液体培养基分装于锥形瓶，其余培养基均制备成平板备用。

1.2 实验方法

1.2.1达乌里胡枝子根瘤内生菌的分离 使用牛肉膏蛋白胨培养基分离根瘤内生菌。将干燥的根瘤样品用无菌水浸泡2 h使其完全吸胀，置于95%乙醇中处理30 s，5% NaClO溶液消毒5 min，无菌水冲洗5～7次。用无菌刀片沿根瘤中间部位切开，将根瘤切面在培养基表面划线，置于28℃恒温培养箱(MJ-I型，上海一恒公司)中培养。待菌落出现后，挑取单菌落继代划线纯化培养，直至获得纯菌株，在斜面培养基上4℃低温保存。

1.2.2根瘤内生解磷菌的初筛及其解磷能力和碱性磷酸酶活性的测定 解磷菌初筛：将保存的根瘤内生菌菌株活化后，制备成菌悬液(OD600=2.0)。吸取5 μL菌悬液，接种在定量20 mL的PKO无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基上，每个菌株4次重复，28℃恒温培养，第7 d采用“十字交叉法”测定透明圈直径(D)和菌落直径(d)，将可溶性指数(D/d)≥1.1的解磷菌用于开展后续试验。

解有机磷和无机磷能力测定：将上述筛选的解磷菌活化后，制备成菌悬液(OD600=0.8)。吸取1 mL菌悬液接种在60 mL蒙金娜液体培养基中，每个菌株3次重复，接种无菌水为对照，28℃、180 r·min-1振荡培养(ZQLY-180E型，上海知楚公司)5 d，混匀取10 mL培养液，10 000 r·min-1离心(H2050R型，湖南湘仪公司)15 min，采用“钼锑抗比色法”测定上清液有效磷含量[29]，确定菌株解有机磷能力，使用pH计测定上清液pH值[14]。以磷酸钙为磷源，定量测定菌株解无机磷能力，方法同解有机磷能力测定。将解有机磷和无机磷试验中上清液有效磷含量显著高于对照的菌株确定为有效解磷菌。

碱性磷酸酶活性测定：使用碱性磷酸酶(AKP/ALP)活性检测试剂盒对上述上清液的碱性磷酸酶活性进行测定。主要步骤有，在37℃，遮光条件下与上清液反应15 min，每mL上清液每min催化产生1 μmol酚定义为1个酶活力单位。

1.2.3根瘤内生解磷菌的鉴定 解磷菌形态特征观察：将筛选的有效解磷菌接种在YMA培养基上，28℃恒温培养2 d，观察菌落形态特征，测量菌落直径；参考伯杰氏细菌系统学手册(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Second Edition，2004)进行革兰氏染色、芽孢染色，使用显微镜(BX50F-3型，日本Olympus公司)观察菌体形态、测量大小，每个菌株测量50个。

解磷菌的生理生化反应：参考沈萍等[30]的方法，对筛选的有效解磷菌进行接触酶反应、淀粉水解反应、明胶液化反应和甲基红反应的测定。

解磷菌的16S rDNA序列相似性与系统发育分析：挑取筛选的有效解磷菌单菌落置于盛有20 μL无菌水的PCR八连排管中，在PCR仪上95℃加热7 min，离心取上清液作为模板DNA备用。利用通用引物P1(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’)和反向引物P6(5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3’)对模板DNA进行扩增。PCR反应体系为2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序为94℃/3 min；94℃/30 s，55℃/30 s，72℃/1 min，30个循环；72℃/5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送上海生工生物工程股份有限公司测序。获得的16S rDNA序列编辑后提交NCBI数据库获得登录号，并利用EZBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/identify/)进行序列比对。使用MEGA 7.0软件将序列与EZBioCloud数据库中的模式菌株序列进行系统发育分析，采用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树，自展值(bootstrap)为1 000次。

1.2.4根瘤内生解磷菌抗逆性测定 有效解磷菌耐盐、耐酸碱性测定：分别制备NaCl含量为0.01%，0.1%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%和pH值为4，5，6，7，8，9，10，11，12的YMA培养基，吸取5 μL有效解磷菌菌悬液(OD600=2.0)接种在不同处理的培养基上，每个菌株3次重复，28℃恒温培养，第3 d测定菌落直径。

有效解磷菌高低温度耐受性测定：吸取5 μL有效解磷菌菌悬液(OD600=2.0)接种在YMA培养基上，每个菌株3次重复，分别置于温度为4℃，20℃，28℃，37℃和60℃的恒温培养箱中培养，第3 d测定菌落直径。

1.2.5根瘤内生解磷菌其它促生特性测定 有效解磷菌其它促生特性测定：对有效解磷菌进行产铁载体能力[25]、产有机酸能力[26]和吲哚反应[28]测定；其中，产铁载体能力和产有机酸能力测定方法如下，将有效解磷菌分别接种在CAS培养基和葡萄糖蛋白胨培养基上，每个菌株4次重复，28℃恒温培养，第5 d采用“十字交叉法”测定透明圈直径(D)和菌落直径(d)，以可溶性指数(D/d)表示菌株产铁载体和产有机酸能力。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2019整理数据，绘制根瘤内生菌属组成的饼图；使用SPSS 26.0进行数据分析，对菌株的可溶性指数、液体培养基中有效磷含量、碱性磷酸酶活性以及其它促生特性等指标进行单因素方差分析和LSD法多重比较(P<0.05)。采用Origin 2021 统计软件绘制根瘤内生解磷菌的解磷能力柱状图。

2 结果与分析

2.1 达乌里胡枝子根瘤内生菌属的组成

从达乌里胡枝子根瘤中分离出88株内生菌，共13属，其中农杆菌属Agrobacterium分离频率最高，为19.3%，短杆菌属Brevibacterium和近芽孢杆菌属Peribacillus次之，分离频率分别为18.2%和17.1%；其它菌株如普里斯特氏菌属Priestia、根瘤菌属Rhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、芽孢杆菌属Bacillus、新根瘤菌属Neorhizobium、黄单胞菌属Xanthomonas、假单胞菌属Pseudomonas、链霉菌属Streptomyces、叶杆菌属Phyllobacterium和泛菌属Pantoea的分离率均小于10.0%(图1)。

图1 达乌里胡枝子根瘤内生菌属的组成Fig.1 Genus composition of nodule endophytic bacteria of Lespedeza daurica

2.2 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的初筛及其解磷能力和碱性磷酸酶活性

2.2.1根瘤内生解磷菌的初筛 初步确定88株内生菌中有11株具有解磷能力，其中1株可单解无机磷(图2B)，8株可单解有机磷(图2A)，2株可兼解无机磷和有机磷(图2)。其中，TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜有机磷培养基以及TG47和TG68在PKO无机磷培养基上的可溶性指数大于1.1。

图2 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的可溶性指数Fig.2 Solubility index of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica 注：A，根瘤内生解磷菌在蒙金娜有机磷培养基上的可溶性指数；B，根瘤内生解磷菌在PKO无机磷培养基上的可溶性指数；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note:A,Solubility index of nodule endophytic phosphate-solubilizing bacteria on organic phosphorus medium;B,Solubility index of nodule endophytic phosphate-solubilizing bacteria on inorganic phosphorus medium;different lowercase letters indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2.2根瘤内生解磷菌解有机磷和无机磷能力及其碱性磷酸酶活性 TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜液体培养基培养5 d后，TG41，TG43，TG47和TG68的培养液有效磷含量显著高于对照(P<0.05)，分别比对照提升了128.1%，159.4%，303.1%和168.8%(图3A)。培养液pH仅TG47比对照高0.03，TG7，TG41，TG42和TG43的培养液pH显著低于对照(P<0.05)，分别比对照下降了0.41，0.33，0.42和0.72(图3B)。TG47和TG68在PKO无机磷液体培养基培养5 d后，TG47的培养液有效磷含量显著高于对照(P<0.05)，比对照提高了234.39倍(图4A)。TG47的培养液pH显著低于对照(P<0.05)，比对照下降了1.04(图4B)。因此，TG41，TG43，TG47和TG68为有效解磷菌。

图3 根瘤内生解磷菌解有机磷能力(A)、培养液pH(B)以及碱性磷酸酶活性(C)Fig.3 Phosphate-solubilizing ability to organic phosphorus (A),pH of culture solution (B) and alkaline phosphatase activity (C) of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

图4 根瘤内生解磷菌解无机磷能力(A)及培养液pH(B)Fig.4 Phosphate-solubilizing ability to inorganic phosphorus (A) and pH of culture solution (B) of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

TG7，TG41，TG42，TG43，TG44，TG47和TG68在蒙金娜液体培养基培养5 d后，TG41，TG42，TG43，TG44和TG47的碱性磷酸酶活性显著高于对照(P<0.05)，分别比对照提升了337.9%，303.5%，466.8%，388.7%和1209.8%(图3C)，其中，TG47的碱性磷酸酶活性显著高于对照和其它菌株(P<0.05)。

2.3 根瘤内生解磷菌的鉴定

2.3.1达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的形态特征 有效解磷菌的菌落均为圆形、边缘完整且中心隆起。其中，TG41和TG43菌落白色，生长2 d的菌落直径分别为6.94和6.99 mm(图5A-a，b)，革兰氏染色阳性(图5B-a，b)，有芽孢(图5C-a，b)，菌体杆状，大小分别为(1.06～1.78)×(1.95～4.11)μm和(1.17～1.55)×(2.60～4.00) μm(表1)；TG47和TG68的菌落分别为乳白色和黄色，生长2 d的菌落直径分别为6.77和5.66 mm(图5A-c，d)，革兰氏染色阴性(图5B-c，d)，无芽孢(图5C-c，d)，菌体直杆状，大小分别为(0.66～0.75)×(1.40～1.79)μm和(0.55～0.91)×(1.18～2.64)μm(表1)。

图5 根瘤内生解磷菌的形态特征Fig.5 Morphological characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica注：A，有效解磷菌的菌落形态特征，a ～ d分别为TG41，TG43，TG47和TG68的菌落；B，有效解磷菌的革兰氏染色结果，a ～ d分别为TG41，TG43，TG47和TG68；C，有效解磷菌的芽孢染色结果，a ～ d分别为TG41，TG43，TG47和TG68；标尺=5 μmNote:A,Colony morphological characteristics of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the colonies of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;B,Gram staining results of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the results of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;C,Spore staining results of effective phosphate-solubilizing bacteria,a ～ d show the results of TG41,TG43,TG47 and TG68,respectively;scale = 5 μm

表1 根瘤内生解磷菌的形态特征Table 1 Morphological characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.3.2达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的生理生化特性 TG41和TG43的过氧化氢酶反应、淀粉水解反应和明胶液化反应均呈阳性，甲基红反应均呈阴性；TG47和TG68过氧化氢酶反应、淀粉水解反应和明胶液化反应均呈阴性；TG47甲基红反应呈阴性，TG68甲基红反应呈阳性(表2)。

表2 根瘤内生解磷菌的生理生化特性Table 2 Biochemical reaction of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.3.3达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌16S rDNA序列相似性与系统发育分析 TG41，TG43，TG47和TG68的GenBank登录号分别为ON529568，ON529570，ON529572和ON529573，16S rDNA序列长度分别为1 458 bp，1 460 bp，1 469 bp和1 506 bp。通过EZBioCloud数据库比对和系统发育分析(图6)，TG41和TG43与模式菌株辣椒芽孢杆菌Bacilluszanthoxyli1433T(登录号：KX865140)的同源性均为99.58%；TG47与模式菌株尊杜克叶杆菌PhyllobacteriumzundukenseTri 48T(登录号：KX426256)的同源性为96.28%；TG68与模式菌株成团泛菌PantoeaagglomeransDSM 3493T(登录号：AJ233423)的同源性为99.10%。结合菌株生理生化特性及培养特征，确定TG41和TG43为辣椒芽孢杆菌Bacilluszanthoxyli，TG47为尊杜克叶杆菌Phyllobacteriumzundukense，TG68为成团泛菌Pantoeaagglomerans。

图6 根瘤内生解磷菌的最大相似性种系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of max similar species of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

2.4 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的抗逆性

TG41，TG43和TG68具有较好的耐盐、耐酸碱能力，分别在盐浓度0.01%～9.00%和pH4～ pH12的培养基上均可生长；TG47次之，可在盐浓度2.00%和pH5～pH10的培养基上生长(表3)。

表3 根瘤内生解磷菌在不同胁迫下的菌落直径Table 3 Colony diameter of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica under different stresses 单位：mm

所有有效解磷菌在60℃均未生长，不耐高温；TG47和TG68在4℃仍可生长，具有一定的耐低温能力。其中，TG41和TG43在20℃～37℃生长良好，TG47和TG68在20℃～28℃生长良好。

2.5 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的其它促生特性

4株有效解磷菌吲哚反应呈阴性，均具有分泌铁载体能力，TG47的分泌能力较强；除TG47的3株有效解磷菌均具分泌有机酸的能力，TG68的分泌能力较强(表4)。

表4 根瘤内生解磷菌的其它促生特性Table 4 Other plant growth-promoting characteristics of endophytic phosphate-solubilizing bacteria isolated from root nodules of Lespedeza daurica

3 讨论

3.1 达乌里胡枝子根瘤内生菌属的组成

豆科植物根瘤是植物-微生物共生的特殊微环境，蕴含着丰富的内生菌资源[31]。达乌里胡枝子具有较高的饲用价值和水土保持能力，是山西省的优良乡土植物，其根瘤内生菌具有较高的研究价值。Palaniappan等[20]从韩国的胡枝子属植物根瘤中分离出39株内生菌，其中伯克氏菌属Burkholderia、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和根瘤菌属Rhizobium为优势属；Busby等[22]对北美6种胡枝子属植物的根瘤进行高通量测序发现，其内生菌种类丰富，共63属，其中慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter和红微菌属Rhodomicrobium为优势属；冀玉良等[32]对商洛地区多花胡枝子分离的根瘤内生菌进行系统发育分析，发现根瘤菌属Rhizobium和中华根瘤菌属Sinorhizobium为优势属。本研究从山西省种植的达乌里胡枝子根瘤中分离出88株内生菌，共13属，其中根瘤菌属Rhizobium和(或)慢生根瘤菌属Bradyrhizobium等在已报道的胡枝子属植物根瘤中均有发现。包括胡枝子在内的豆科植物上，这些根瘤菌也是形成根瘤，产生固氮功能的必要物种[33]。与上述研究有所不同，本研究中农杆菌属Agrobacterium、短杆菌属Brevibacterium和近芽孢杆菌属Peribacillus为优势属，这表明不同地区的胡枝子属植物根瘤内生菌多样性丰富，但优势属存在差异，这可能是胡枝子物种、生长的地理位置、气候和土壤条件[34]以及人类活动[35]共同作用所致。此外，本研究还分离出胡枝子属植物根瘤中尚未报道的内生菌，包括新根瘤菌属Neorhizobium、短杆菌属Brevibacterium、近芽孢杆菌属Peribacillus、普里斯特氏菌属Priestia、假单胞菌属Pseudomonas、链霉菌属Streptomyces、叶杆菌属Phyllobacterium和泛菌属Pantoea等，极大地丰富了胡枝子属植物的根瘤内生菌资源库。

3.2 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的类型、解磷能力及解磷方式

不同功能的内生菌以构建复合菌群的方式在根瘤内共存[10]，其中包括兼具固氮和解磷能力的内生菌[36]和具有解磷能力的非固氮内生菌[40]等，能够分解土壤中的难溶性磷供其自身构建细胞和植物生长利用[37]或者分解根瘤内部的难溶性磷供根瘤菌利用[40]。陈晓琳等[38]从花榈木Ormosiahenryi根瘤中分离筛选出1株解磷能力较强的内生菌，解有机磷和无机磷量分别为71.2和31.1 μg·mL-1，固氮酶活性为2.54 μmol·g-1·h-1，经回接试验确定为根瘤菌；韩梅等[39]从大豆根瘤中筛选出1株兼具固氮和解磷能力的快生型根瘤菌，第7 d解磷量为35.5 μg·mL-1；本研究中TG47和TG68兼具固氮(未发表数据)和解磷能力，经鉴定分别为尊杜克叶杆菌Phyllobacteriumzundukense和成团泛菌Pantoeaagglomerans，表明达乌里胡枝子根瘤中还存在除根瘤菌以外的其它兼具固氮能力的解磷菌，这可能是在协同进化过程中发生了共生基因的横向转移[41]。此外，根瘤中还存在具有解磷能力的非固氮内生菌，Mohsin等[42]从豌豆Pisumsativum根瘤中筛选出4株具有解磷能力的非固氮内生菌，解无机磷量为5.57～11.73 μg·mL-1，分别为苍白杆菌属Ochrobactrum和肠杆菌属Enterobacter；钟宇舟等[43]从大豆根瘤中分离了5株为非固氮内生菌，解磷量为7.47～10.62 μg·mL-1，分别为芽孢杆菌属Bacillus、肠杆菌属Enterobacter和假单胞菌属Pseudomonas；本研究中TG41和TG43解有机磷量为0.73和0.83 μg·mL-1，无固氮能力，经鉴定均为辣椒芽孢杆菌Bacilluszanthoxyli，这表明不同豆科植物与根瘤内生菌建立的共生体中，解磷菌的类型和解磷能力存在差异。本研究已从胡枝子根瘤中分离出具有解磷能力的内生菌，其能否为根瘤菌固氮作用提供磷元素，这还需要通过同位素标记等方法，对内生菌磷转化和吸收的途径进行进一步研究。

3.3 达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的抗逆和促生潜力

达乌里胡枝子是黄土高原地区的代表性植物之一，能与根瘤菌共生，具有良好的环境适应性[19]。内生菌在与宿主植物长期协同进化过程中，能够通过诱导系统抗性以及增强对环境胁迫的耐受性来促进植物生长[49]。本研究从达乌里胡枝子根瘤内分离的芽孢杆菌属Bacillus和泛菌属Pantoea具有解磷能力和良好的耐盐、耐酸碱能力，并且与Palaniappan等[21]的研究相比，本研究中达乌里胡枝子根瘤内生解磷菌的属组成也更加丰富，这可能是达乌里胡枝子具有良好适应性的原因之一。此外，在豆科植物-根瘤菌共生体中，铁参与固氮酶、豆血红蛋白和铁氧化还原蛋白等关键物质的合成[50]，对于维持根瘤的固氮活性具有重要意义[51]，本研究筛选的4株有效解磷菌兼有分泌铁载体能力，可螯合周围环境中的铁改善自身营养状况，还能供给植物或与病原微生物竞争铁营养，达到促生防病的目的[52]，但其能否为根瘤菌固氮酶等关键物质的合成提供铁元素仍有待进一步研究。因此，4株有效解磷菌具有较好的抗逆能力和促生潜力，为黄土高原甚至退化盐碱地建植达乌里胡枝子使用的根瘤微生物复合菌剂提供了菌种资源。因此，后续将进一步开展根瘤菌属Rhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和新根瘤菌属Neorhizobium的结瘤固氮能力及田间促生效果研究，并进行根瘤内生解磷菌与根瘤菌的复合接种试验，探究其对根瘤菌结瘤固氮所发挥的作用。

4 结论

山西省种植达乌里胡枝子的根瘤内生菌资源丰富，分属13属，除豆科植物形成根瘤的常见根瘤菌属Rhizobium和慢生根瘤菌属Bradyrhizobium外，农杆菌属Agrobacterium、短杆菌属Brevibacterium和近芽孢杆菌属Peribacillus也是其优势根瘤内生菌。其中，4株为有效解磷菌，分别为辣椒芽孢杆菌Bacilluszanthoxyli(TG41和TG43)、尊杜克叶杆菌Phyllobacteriumzundukense(TG47)和成团泛菌Pantoeaagglomerans(TG68)，解有机磷量为0.73～1.29 μg·mL-1，TG47和TG68解无机磷量为72.97和1.29 μg·mL-1，菌株分泌磷酸酶为解磷的主要方式。4株解磷菌均能分泌铁载体，TG41、TG43和TG68还能分泌有机酸，具有一定的促生潜力。此外，这些菌株具有较强的耐盐和耐酸碱能力，可用于后续研发适合黄土高原甚至退化盐碱地建植达乌里胡枝子使用的根瘤微生物复合菌剂。