外周循环线粒体DNA拷贝数与急性心肌梗死患者近期预后的相关性研究

鲁召辉，宋红星，马龙飞，韩欣宇，郭赫立

急性心肌梗死患者在有效治疗后，其缺血心肌组织可再次灌注血流。但血液灌注带来的氧气会激发过度的氧化应激，对组织造成二次损伤[1]。因此，这一时期的患者病情并不稳定，容易出现致命性心律失常等多种不良心血管事件。如果治疗不及时，可造成患者病情加重甚至死亡。因此，准确预测急性心肌梗死患者近期不良心血管事件的发生，具有重要的临床意义。但目前相关预测手段十分有限。

线粒体是真核细胞有氧呼吸和能量代谢的场所，拥有自己的遗传物质，即线粒体DNA（mtDNA）。既往研究发现，急性心肌梗死与线粒体关系密切[2,3]。在冠状动脉（冠脉）血供中断时，心肌线粒体功能发生障碍，造成能量供应不足。线粒体膜结构不再完整，mtDNA等物质被释放出来，诱发炎症和氧化应激反应，进一步加重心肌损伤[4,5]。同时，由于心脏在循环系统中的核心地位，释放出来的心肌mtDNA可便捷地进入外周循环。因此，理论上讲，外周循环中的mtDNA浓度可能与心肌线粒体乃至心肌损伤的程度存在关联，进而使外周循环mtDNA成为一种潜在的急性心肌梗死预后指标。少数学者针对这个假设进行了初步研究，结果发现，外周循环mtDNA浓度升高与急性冠脉综合征所致死亡存在关联，而外周循环mtDNA呈阳性，结合其他线粒体指标的异常，可预测急性心肌梗死的不良预后[6,7]。但是，定量的检测急性心肌梗死患者外周循环的mtDNA拷贝数，研究后者对患者发病近期多种不良心血管事件发生的预测作用，国内外文献鲜有报道。

本研究采用急性ST段抬高型心肌梗死患者的血液样本和临床数据，探讨外周循环mtDNA拷贝数与多种不良心血管事件的相关性。研究结果有助于临床医务人员更加准确地评估急性心肌梗死患者的近期预后，有助于他们更深刻地了解线粒体在疾病转归中的作用，为丰富急性心肌梗死的治疗策略提供现实依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象于2018年1月至2020年12月期间就诊于郑州市第七人民医院心内科的急诊患者。全部受试者均符合以下纳入标准：①根据中华医学会颁布的《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南（2019）》，确诊为急性ST段抬高型心肌梗死[8]。②患者均接受急诊经皮冠状动脉介入术（PCI），并住院接受后续治疗。③无其他慢性疾病，或其他慢性疾病病情处于稳定期。④患者或家属签署知情同意书。

1.2 病史采集研究人员查阅病历，采集患者年龄、性别、吸烟史、既往疾病史和本次入院情况等研究数据。其中，吸烟史定义为患者在日常生活中存在自发的至少6个月的规律吸烟，故偶尔吸烟不在此列。既往疾病史根据病历资料中所记录的既往诊断过程和服用相关药物情况确定。

1.3 血液采集与检测于接受急诊介入治疗前采集患者静脉血5 ml。样本mtDNA拷贝数采用qPCR方法测定[9,10]。首先，应用DNeasy全血与组织DNA提取试剂盒提取血液DNA（Qiagen）。然后，DNA样本应用Sybr Green染色qPCR检测试剂盒和ABI7300实时荧光定量PCR系统进行定量测定（Applied Biosystems）。其中，人类NADH脱氢酶1基因（mtDNA）正向引物为5’-ATACCCATG GCCAACCTCCT-3’，反向引物为5’-GGGCCTT TGCGTAGTTGTAT-3’。人类肌动蛋白（细胞核DNA，nDNA）正向引物为5’-TAAAGCGGCCTT GGAGTGTG-3’，反向引物为5’-GAACACGGC TAAGTGTGCTG-3’。qPCR反应条件为20 μl，50 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 min，95 ℃复性15 s，60 ℃延伸60 s，共40个循环。所有样本检测3遍。最后，绘制标准曲线，计算mtDNA和nDNA的绝对量，mtDNA拷贝数由mtDNA/nDNA表示。

1.4 分组与随访根据外周循环mtDNA拷贝数对患者进行分组。其中，未检测到mtDNA的患者分入“mtDNA阴性组”，在外周循环中检测出mtDNA的患者根据检测结果中位数分入“mtDNA高水平组”和“mtDNA低水平组”。

所有患者接受自发病之日起的30 d例行随访，住院患者通过查阅病历完成，已出院的患者通过门诊复诊、电话询问和查阅病历相结合的方式完成。记录不良心血管事件的发生，主要包括心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室传导阻滞（二度Ⅱ型或三度）、室性心动过速/心室颤动和心源性死亡。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0进行数据统计分析。计量资料以算术均数±标准差表示，两个组之间的比较应用独立样本t检验，三个组之间的比较应用方差分析及LSD检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用卡方检验。根据mtDNA水平的分组情况定义为自变量，不良心血管事件发生与否定义为表示状态的因变量，不良事件从基线至发生的时长定义为表示时间的因变量，应用多因素COX回归评估mtDNA与不良心血管事件之间的相关性，报告风险比（HR）、95%可信区间（95%CI）以及相对应的P值。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性心肌梗死患者的一般资料如表1所示，共253例急性心肌梗死患者纳入本研究。其中，mtDNA高水平组113例，mtDNA低水平组113例，mtDNA阴性组27例。性别、年龄、吸烟史和既往史在三组间无统计学差异（P＞0.05）。在入院情况方面，外周循环TnI浓度在mtDNA高水平组、mtDNA低水平组和mtDNA阴性组之间呈现逐渐降低的趋势，且该指标在mtDNA高水平组和mtDNA阴性组之间具有统计学差异（P=0.025）。心脏彩超LVEF值呈现逐渐增高的趋势，在mtDNA高水平组和mtDNA阴性组之间也具有统计学差异（P=0.040）。而收缩压、心率和前壁心梗例数在三组间无统计学差异（P＞0.05）。

表1 急性心肌梗死患者一般资料比较

2.2 外周循环mtDNA水平及其与TnI、LVEF的相关性外周循环mtDNA拷贝数在mtDNA高水平组中显著高于mtDNA低水平组（963.7±375.8 copies/ml，306.0±165.7 copies/ml，P＜0.001）（图1A）。外周循环mtDNA水平与TnI水平无显著的线性相关关系（r=0.098，P=0.141），与心脏彩超LVEF值呈现轻微显著的线性相关关系（r=-0.131，P=0.049），（图1B，图1C）。

图1 外周循环mtDNA水平及其与TnI、LVEF的相关性（注：*提示P＜0.05）

2.3 急性心肌梗死患者近期不良心血管事件发生情况在急性心肌梗死发病30 d内，心力衰竭（Killip’sⅡ～Ⅳ）和房室传导阻滞（二度Ⅱ型或三度）的发生在三个研究组中存在显著差异。具体表现为，与mtDNA阴性组相比，上述两种不良心血管事件在mtDNA高水平组中发生更加常见（P=0.011，P=0.040）。而室性心动过速/心室颤动和心源性死亡的发生在上述三个研究组中无统计学差异（P=0.160，P=0.616），表2。

表2 急性心肌梗死患者近期不良心血管事件发生情况

2.4 外周循环mtDNA阳性与近期不良心血管事件发生相关性的多因素COX回归分析在本研究中，mtDNA高水平组和mtDNA低水平组的患者归入mtDNA阳性组进行数据分析。如表3所示，外周循环mtDNA检测阳性组急性心肌梗死发病30 d内出现心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室传导阻滞（二度Ⅱ型或三度）、室性心动过速/心室颤动和心源性死亡发生风险与对照组相比无明显差异（P＞0.05）。

表3 外周循环mtDNA阳性与近期不良心血管事件发生相关性的多因素COX回归分析

2.5 外周循环mtDNA拷贝数与近期不良心血管事件发生相关性的多因素COX回归分析与拥有较低外周循环mtDNA拷贝数的患者相比，外周循环mtDNA拷贝数较高的患者发生心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室传导阻滞（二度Ⅱ型或三度）和室性心动过速/心室颤动的可能性更大（P=0.007，P=0.031，P=0.013）。同时，本研究未发现外周循环mtDNA拷贝数与心源性死亡之间存在统计学关联（P=0.109），表4。

表4 外周循环mtDNA拷贝数与近期不良心血管事件发生相关性发生的多因素COX回归分析

3 讨论

急性心肌梗死冠脉再通后的“缺血再灌注损伤”说明冠脉血供中断所造成的心肌缺血性坏死只是疾病演进的第一阶段。此后，氧化应激反应、炎症反应等一系列病理生理过程也会参与进来。即使血供恢复，这些病理生理过程也不会立即中止，甚至会进一步加剧，并持续损伤心肌组织[11,12]。上述特点造成急性心肌梗死患者在发病早期病情十分不稳定，易出现心力衰竭、致命性心律失常等危险情况。因此，根据患者疾病危险性采取个体化的治疗措施是必要的。但如何准确评价患者的疾病危险性，预测不良心血管事件的发生，是临床工作者面临的难题。

既往研究发现，急性心肌梗死会导致心肌线粒体功能障碍，而氧化应激反应、炎症反应等又与线粒体功能关系密切。因此，线粒体相关指标的变化可能反映心肌损伤程度和多种继发病理生理过程的严重程度。在此推测的基础上，周双艳等[13]的研究发现，急性心肌梗死患者血浆游离mtDNA拷贝数显著升高，后者可能成为辅助诊断心肌梗死的生物学标志。胡汉等[14]研究进一步证实，外周循环mtDNA拷贝数对急性心肌梗死的诊断价值可能与氧化应激反应有关。两项国外研究也初步揭示，外周循环mtDNA浓度可能与急性冠脉综合征的不良预后有关[6,7]。但是，探讨外周循环mtDNA拷贝数在急性心肌梗死中的预后价值的研究仍然较少，而专门探讨其对发病早期不良心血管事件的预测价值的研究未见报道。

本研究发现，一小部分急性心肌梗死患者并未在外周循环中检测到游离的mtDNA，这可能与患者心肌损伤较轻有关。还有另外一种可能的解释，即血液采集时间距离发病时间过近。因为急性心肌梗死后线粒体损伤并出现mtDNA大量释放入血需要一定时间，这与心肌酶在发病后数小时才能检测到的情况类似。我们在本实验设计时考虑到了上述因素，安排所有患者在接受介入治疗前采集血液，预留了比较充足的时间。因此，采血时机对于本研究的影响较小。

本研究还发现，多种不良心血管事件的发生在这些检测阴性的患者和检测阳性的患者之间并无统计学差异。而在检测阳性的患者中，mtDNA拷贝数较高的患者发生心力衰竭和恶性心律失常的危险性明显更高。说明外周循环mtDNA定量测定比定性测定具有更高的针对近期不良心血管事件的预测价值。

另外，不论在定性分析中，还是在定量分析中，本研究均未发现外周mtDNA拷贝数能够预测心源性猝死。可能与样本量较小，影响了检验效能有关。样本量偏小是本研究的主要不足之处。造成这种情况的原因为就诊的急性心肌梗死患者数量有限、纳入标准较高（不符合要求的患者被直接排除）和部分患者不愿加入本研究。但是，本研究仍然在外周循环mtDNA拷贝数预测心力衰竭、房室传导阻滞和室性心律失常方面取得了阳性结果，为今后开展大样本量的研究奠定了基础。

外周循环mtDNA拷贝数预测急性心肌梗死近期预后的机制尚不清楚。本研究的初步结果显示，在外周循环mtDNA拷贝数较高的患者中，外周循环TnI水平较高，而心脏彩超LVEF值较低。进一步的数据分析发现，mtDNA拷贝数与TnI水平、LVEF值几乎或者已经具有线性相关关系。众所周知，外周循环TnI水平与心肌坏死程度有关，LVEF值与心脏收缩力有关，进而与具有收缩功能的心肌细胞数量有关[15,16]。另一方面，线粒体是供应心肌细胞能量的细胞器，大量mtDNA进入外周循环预示着心肌细胞坏死[17]。因此，外周循环mtDNA拷贝数间接反映急性心肌梗死中心肌组织存活情况可能是其预测预后的机制之一。

综上所述，外周循环mtDNA拷贝数与急性心肌梗死近期多种不良心血管事件的发生相关，较高的外周循环mtDNA拷贝数是急性心肌梗死近期预后不良的重要提示。因此，常规检测外周循环mtDNA拷贝数，了解患者的疾病发展危险性，及时采用个性化的救治措施，可能有效提高急性心肌梗死的治疗效果，改善患者预后。