外周血滤泡辅助性T细胞表达与哮喘患者病情的相关性＊

蔡丹磊 倪凯华 韩毓 黄中伟 董岩松

WHO将支气管哮喘定义为四大顽疾之一，也是现今全球公认的健康问题。由于支气管哮喘患病较高，加之该疾病的临床症状也十分典型，对患者的生活质量影响较大[1]。支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，既往的研究表明，该疾病的发生与多种炎症细胞和炎症介质参与息息相关，其临床表现为气道高反应性、可逆性气流受阻及气道炎症细胞浸润[2]。辅助性T细胞1（Th1）、辅助性T细胞2（Th2）、辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）等CD4+T细胞在支气管哮喘中的发病作用已有较多的学者进行报道研究[3-5]，但是由于支气管哮喘的发病机制较为复杂，用各个细胞的比例失衡并不能很好地解释。国外的两位学者几乎同时报道了一种定位于淋巴滤泡、具有辅助B细胞功能、表型为CXCR5+CD40L+ICOS+T细胞亚群，称为滤泡辅助性T细胞（Tfh）[6-7]。与既往的研究不同，该学者认为Tfh细胞是不同于Th1、Th2、Treg、Th17的一个新的T细胞亚群。而目前尚无哮喘中Tfh细胞的作用及机制方面的研究报道。基于此，本次研究着重探讨哮喘患者外周血滤泡辅助性T细胞表达调控机制，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析南通大学附属医院2020年10月-2021年3月收治的哮喘患者42例，纳入标准：（1）符合哮喘临床诊断标准；（2）7 d内未应用糖皮质激素或其他免疫抑制剂治疗；（3）7 d内无急性感染，无其他慢性病史；（4）患者知情同意。排除标准：（1）拒绝参加；（2）合并严重的器质性病变；（3）恶性肿瘤；（4）依从性差。根据疾病严重程度，分为急性发作组（n=23）、缓解组（n=19）；另选取同期在本院体检的健康人群30例作为对照组。对照组中男15例，女15例；年龄7～45岁，平均（25.95±2.44）岁。急性发作组中，男11例，女12例；年龄9～48岁，平均（25.91±2.41）岁。缓解组中，男9例，女10例；年龄8～48岁，平均（25.64±2.81）岁。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本次研究获得本院医学伦理会批准。

1.2 方法

1.2.1 采用流式细胞术分析Tfh细胞的分化数量所有患者均于清晨采集空腹静脉血，肝素锂抗凝处理后，将100 μl的全血置于15 ml的离心管中，分别加入：10 μl PE-CD278、10 μl FITC-CD4、5 μl PerCP-cyTM-5.5-CXC R5流式抗体，避光孵育半小时后，加入1 ml xBECKMAN Optil-yse C，轻轻混匀后避光15 min。使用离心机进行离心处理（3 000 r/min，5 min），弃上清后收集细胞，细胞使用2 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行洗涤，随后再次离心（1 000 r/min，5 min），弃上清后收集细胞。随后根据适合体积的PBS重悬，调整细胞浓度，再次离心处理（1 000 r/min，5 min）。所有试剂均购于BD公司。

1.2.2 外周血中Tfh胞内细胞因子合成水平 采用流式细胞术激活细胞后分别对Tfh细胞膜表面分子CD4和CXCR5及胞内特征性细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-21（IL-21）进行荧光染色，采用流式细胞术分析Tfh细胞内IL-4和IL-21的合成水平，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理

本次试验采用SPSS 22.0统计分析软件，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组外周血滤泡辅助性T细胞表达水平对比

对照组的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表达水平高于急性发作组、缓解组，CD4+ICOS+CXCR5+表达水平及IL-4、IL-21水平低于急性发作组、缓解组，差异均有统计学意义（P<0.05）；急性发作组的CD4+ICOS+CXCR5+表达水平及IL-4、IL-21水平高于缓解组，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表达水平低于缓解组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 三组外周血滤泡辅助性T细胞表达水平对比（±s）

表1 三组外周血滤泡辅助性T细胞表达水平对比（±s）

*与对照组比较，P<0.05；#与急性发作组比较，P<0.05。

组别 CD4+ICOS+ CD4+CXCR5+ CD4+ICOS+CXCR5+ IL-4（ng/L） IL-21（ng/L）对照组（n=30） 10.84±1.22 3.59±0.31 4.07±0.52 55.45±5.42 15.49±1.94急性发作组（n=23） 7.39±0.91* 1.49±0.46* 12.29±1.22* 188.92±23.55* 18.39±2.31*缓解组（n=19） 8.49±0.16*# 2.14±0.75*# 6.49±0.34*# 128.93±15.55*# 16.94±1.33*#F值 92.120 132.060 126.164 466.406 14.687 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 外周血滤泡辅助性T细胞表达水平与哮喘病情的相关性分析

Spearman相关性分析显示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+与哮喘病情存在负相关关系，CD4+ICOS+CXCR5+、IL-4、IL-21表达水平与哮喘病情存在正相关关系（P<0.05），见表2。

表2 外周血滤泡辅助性T细胞表达水平与哮喘病情的相关性对比

3 讨论

数据报道指出，近20年以来，青少年的支气管哮喘的发病率不断上升，约有40%的青少年患有哮喘[8-10]。有研究指出，发达国家儿童的患病率为10%～30%[11-13]。我国哮喘发病率相对发达国家低，但是随着我国经济水平的不断发展、环境问题的加剧，我国支气管哮喘患病率较10年前约增高1倍，且呈现年轻化趋势。哮喘的发生与多种炎症因子的共同参与有关，现今多数研究认为，T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、气道上皮细胞和免疫球蛋白E（IgE）、免疫球蛋白G（IgG）等介导了支气管哮喘的发生与发展[14-16]。在免疫学角度，支气管哮喘的发生与机体自身接触过敏原而引发的超敏反应有关，其主要表现为IgE介导的变态反应。当机体再次接触过敏原时，IgE交联导致肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒释放炎性介质引起气道的高反应性，进而引起哮喘发作[17]。哮喘不仅会对人们的身体健康造成影响，还会加重人们的生活负担及精神压力。临床上对于哮喘尚无根治方法，针对此，加强对哮喘疾病发病机制的研究十分重要。

目前，多数学者均认为，哮喘的发生与免疫功能紊乱有关，也是导致哮喘发生的重要机制之一[18]。也有学者认为，哮喘的发生与气道炎症有关[19]。有学者的研究认为，Th1、Th2细胞通过分泌IL-4及γ-干扰素（IFN-γ）从而刺激B细胞增殖与类别转换重组（CSR），从而产生免疫球蛋白，促进哮喘疾病的发生[20]。既往认为，Th2是辅助B细胞的主要辅助性T细胞，Tfh细胞是最近新发现的一种辅助性T细胞，在转录因子B细胞淋巴因子-6的调控下，辅助性T淋巴（Th）细胞可分化为Tfh细胞，该细胞能够持续表达CXCR5，自分泌方式分泌IL-21。Tfh细胞比例失衡或功能失调参与了多种疾病的发生。Tfh细胞在自身免疫性疾病中的发生机制已经得到了广大学者的研究支持[21]。系统性红斑狼疮患者的Tfh细胞异常增多，这与患者自身靶器官受损、自身抗体失衡的严重程度有关[22-23]。

结合本次研究结果：对照组的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表达水平高于急性发作组、缓解组，CD4+ICOS+CXCR5+表达水平及IL-4、IL-21水平低于急性发作组、缓解组，差异均有统计学意义（P<0.05）；急性发作组的CD4+ICOS+CXCR5+表达水平及IL-4、IL-21水平高于缓解组，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表达水平低于缓解组，差异均有统计学意义（P<0.05）。分析认为，多种细胞及分泌均参与了IgE水平的调控，而哮喘患者IgE水平的高低与疾病息息相关，IgE上升，促进疾病的发展，也有学者的研究证实了这一观点[24]。细胞因子微环境失衡也可能导致哮喘患者体内IgE水平的提升，而IL-4调节CD4+T细胞向Th2分化，从而促进B细胞分化，促进免疫球蛋白向IgE转化，促进哮喘的发生。Spearman相关性分析显示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+CXCR5+表 达 水 平 的 高低、IL-4、IL-21水平与哮喘病情存在显著相关性（P<0.05）。分析认为，哮喘患者存在Th2细胞比例失衡，外周血分泌IL-4的T细胞比例也存在失衡，进而导致哮喘患者的免疫应答偏移，发挥协同作用，进一步促进哮喘疾病的发生与发展[25]。

综上所述，外周血滤泡辅助性T细胞可能参与了哮喘疾病的发生与发展，外周血滤泡辅助性T细胞表达水平与IL-4、IL-21水平高低可以作为哮喘疾病的评估与诊断指标之一。