基于PI3K/Akt/mTOR通路探讨川芎嗪诱导人胃癌细胞凋亡和自噬作用的机制研究*

霍浩然，秦瑞峰，薛佳栋，袁增江

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001

近年来，随着人们健康意识的提高及预防幽门螺杆菌根除等措施的实施，胃癌发病率和致死率呈下降趋势，但仍居恶性肿瘤致死率的第三位，仅次于肺癌和肝癌［1］。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是存在于川芎、温莪术等植物根茎中的一种活性生物碱，化学名2，3，5，6-四甲基吡嗪，具有较为广泛的抗肿瘤活性，已证实TMP对肺癌［2］、肝癌［3］、肾癌［4］等具有抑制作用，病理生理学研究发现TMP的抑癌作用可能与促进癌细胞凋亡与自噬有关。磷脂酰肌醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是调控细胞凋亡自噬的关键信号通路［5］。本实验旨在研究TMP对胃癌细胞凋亡和自噬的影响以及PI3K/Akt/mTOR通路所发挥的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞人胃癌SGC-7901细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学研究所（编号：SCSP-573）。

1.2 药物及试剂磷酸川芎嗪注射液（扬子江药业集团有限公司，批号：20191219）；PI3K特异性抑制剂LY294002、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑（tetramethylazoazole，MTT）（美 国Sigma公 司，批 号：L9908、302A035、C208A）；DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号：AE20005267）；0.25%胰酶、胎牛血清（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20190416、20190504）；Annexin V-FITC/PI试剂盒（上海碧云天生物技术公司，批号：C1063）；兔抗鼠磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、β-actin单克隆抗体和山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号190130、190425、190319、190508、181204、190426、190131、190511）；DAB显色试剂盒（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：20190327）。

1.3 仪器HF240型细胞培养箱（上海力申科学仪器公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国Becton Dicknson公司）；5427R型低温高速离心机（德国Eppendrof公司）；BX53型荧光显微镜（日本Olympus公司）；SE300型蛋白质电泳仪（美国Hoefer公司）；DYCZ-40D型电泳槽（北京六一仪器厂）；Power-pac 3000型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；VARIOSKANLUX型多功能酶标仪（美国Thermo Scientific公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养实验用SGC-7901细胞解冻复苏后接种于含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基，置5%二氧化碳、恒温37℃、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，细胞汇合度约80%时进行传代；取对数生长期细胞进行实验，设空白对照组（DMSO）、TMP（200、400、800 μg/mL）［6］和LY2940025 μg/mL［7］干预组。

1.4.2 细胞增殖抑制率检测取对数生长期SGC-7901细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×104个/mL，200 μL/孔接种于96孔板，继续培养24 h待细胞贴壁后更换培养基，分别以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL进行干预，每组设10个复孔，48 h后20 μL/孔加入浓度5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h后弃培养液，150 μL/孔加入DMSO室温避光震荡至结晶完全溶解后，通过酶标仪测定490 nm处吸光度值（OD490nm）。

细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD490nm/空白对照组OD490nm）×100%

1.4.3 细胞凋亡水平检测取对数生长期SGC-7901细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×104个/mL，200 μL/孔接种于培养皿（内置消毒玻片），培养48 h后更换培养基，分别以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL进行干预，每组设10个培养皿，继续培养48 h后0.25%胰酶消化、离心半径10 cm，1500 r/min离心5 min后弃上清，经PBS溶液洗涤3次后，严格按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明进行操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平并计算凋亡率。

1.4.4 细胞自噬水平检测取对数生长期SGC-7901细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105个/mL，200 μL/孔接种于24孔板，继续培养24 h待细胞贴壁后更换培养基，分别以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL进行干预，每组设10个复孔，继续培养48 h后弃培养液并用PBS溶液洗涤3次，500 μL/孔滴加浓度为1 mg/L的吖啶橙溶液避光孵育15 min，PBS溶液洗涤3次后通过荧光显微镜观察并拍照。

1.4.5 细胞蛋白表达水平检测取对数生长期SGC-7901细胞经0.25%胰酶消化后，调整细胞浓度为1×104个/mL，200 μL/孔接种于培养皿（内置消毒玻片），培养48 h后更换培养基，分别以DMSO、TMP（200、400、800 μg/mL）或LY294002 5 μg/mL进行干预，每组设10个培养皿，继续培养48 h后0.25%胰酶消化、离心半径10 cm，1500 r/min离心5 min后弃上清取细胞，于冰上裂解细胞后4℃、离心半径10 cm，12 000 r/min离心15 min去上清，BCA法测定总蛋白浓度后行沸水浴变性，取40 μg总蛋白量上样、行SDS-PAGE凝胶电泳、湿转法将蛋白转移到PVDF膜、5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，滴加p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、LC3、β-actin一抗后4℃孵育过夜，PBS溶液洗涤3伺候滴加二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB显色剂；以β-actin为内参，通过条带灰度值半定量蛋白表达量。

1.5 统计学方法运用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMP对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率和细胞凋亡的影响与空白对照组比较，TMP（200、400、800 μg/mL）组和LY294002 5 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率明显升高（P＜0.01）；与LY294002 5 μg/mL组比较，TMP 800 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率明显升高（P＜0.05）。见图1—3。

图1 TMP对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制率的影响

2.2 TMP对人胃癌SGC-7901细胞自噬的影响红色荧光为阳性着色，表示自噬溶酶体。与空白对照组比较，TMP 200、400、800 μg/mL组和LY2940025 μg/mL组红色荧光呈不同程度增多，并且TMP作用呈现一定剂量依赖性，提示SGC-7901细胞经TMP或LY294002干预后自噬溶酶体明显增多，即TMP具有诱导SGC-7901细胞自噬的作用。见图4。

图2 TMP对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

图3 TMP对人胃癌SGC-7901细胞凋亡率的影响

图4 荧光显微镜下TMP对人胃癌SGC-7901细胞自噬的影响

2.3 TMP对人胃癌SGC-7901细胞p-PI3K、p-Akt、pmTOR蛋白表达的影响与空白对照组比较，TMP 400、800 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相 对 表 达 量 明 显 降 低（P＜0.05）；与LY294002 5 μg/mL组比较，TMP 800 μg/mL组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相对表达量降低（P＜0.05）。见图5。

图5 TMP对人胃癌SGC-7901细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达的影响

2.4 TMP对人胃癌SGC-7901细胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的影响与空白对照组比较，TMP 400、800 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9相对表达量明显提高（P＜0.05）；与LY294002 5 μg/mL组比较，TMP 800 μg/mL组Cleaved Caspase-3相对表达量明显提高（P＜0.01）。见图6。

图6 TMP对人胃癌SGC-7901细胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的影响

2.5 TMP对人胃癌SGC-7901细胞LC3蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影响与空白对照组比较，TMP 400、800 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组LC3-Ⅱ、LC3-I相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显提高（P＜0.01）；与LY294002 5μg/mL组比较，TMP 800 μg/mL组LC3-Ⅱ、LC3-I相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-I比值明显提高（P＜0.05）。见图7。

图7 TMP对人胃癌SGC-7901细胞LC3蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影响

3 讨论

胃癌是全球范围内最常见的消化系统肿瘤之一，每年新发病例约100万，每年病死人数约74万［8］。中医药抗肿瘤有独到的理论体系与诊疗优势［9］，胃癌属中医“噎膈”“积聚”等范畴，其病机主要在于脾胃虚寒、瘀毒内阻、气血双亏所致胃脘气滞食积、痰凝血瘀、结而成积。

中药川芎是主产于我国四川省、云南省、贵州省等地的一种伞形科蒿本属植物，它辛温香燥，《日华子本草》记载其“上行可达巅顶、下行可达血海”“治一切风、一切气、一切劳损、一切血，排脓消瘀血”，具有广泛的活血祛瘀功效。中药川芎的主要活性成分TMP是一种吡嗪生物碱，既往文献［10］报道TMP可干预细胞凋亡自噬而抑制肿瘤。本研究发现，TMP可明显抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，促进其凋亡和自噬，并且800 μg/mL TMP组对SGC-7901细胞增殖、凋亡和自噬的效应优于LY294002组，提示TMP可促进胃癌细胞凋亡和自噬。

细胞凋亡和自噬是细胞两条程序化死亡途径，二者可作为抗癌治疗的靶点［11］。因肿瘤局部环境缺氧、Ca2+过载等将导致线粒体膜孔道开放度异常升高，致使线粒体内细胞色素C（cytochrome c，Cyt C）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）等释放进入细胞质，二者能够陆续活化Caspase-9、Caspase-3蛋白，其中Caspase-3可剪切破坏核酸、膜蛋白、结构蛋白等分子结构而导致细胞凋亡。LC3是细胞自噬的标志性蛋白，分为无生理活性的LC3-Ⅰ亚型和有促细胞自噬活性的LC3-Ⅱ亚型。文献［12］报道显示，自噬状态下无活性的LC3-Ⅰ可酶解一段多肽而成为有自噬活性的LC3-Ⅱ，所以LC3-Ⅱ/LC3-I比值可体现细胞自噬状况。

Akt为PI3K下游靶基因，其表达与活化受PI3K调控。p-PI3K、p-Akt为二者活化状态，p-Akt可间接抑制Caspase-3活化而抑制细胞凋亡［13］。mTOR是调控细胞自噬的关键蛋白，p-mTOR为其活化状态，有文献［14］报道p-mTOR可清除泛素蛋白而阻碍细胞自噬进程，而mTOR磷酸化过程受p-Akt调控。研究发现，给药干预PI3K/Akt/mTOR通路活化可促进胃癌细胞凋亡和自噬。本研究发现，TMP可明显降低SGC-7901细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR相对表达量，提高Cleaved Caspase-3、Caspase-9、LC3-Ⅱ相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值［15］；除Caspase-9外，800 μg/mL TMP组对其他蛋白表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的效应优于LY294002组，提示TMP促进胃癌细胞凋亡和自噬的作用可能与抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化有关。

综上所述，TMP可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化而诱导人胃癌细胞凋亡和自噬，本研究结果为TMP做为胃癌治疗药物提供了理论依据。