基于网络药理学探讨“兰州方”治疗急性髓系白血病的机制*

唐小龙，杨丽霞，缪延栋，哈武华，米登海，△

1川北医学院附属医院，四川 南充 637000;2兰州大学第一临床医学院；3甘肃省中医药研究院

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是危害人类健康的重大疾病［1］。AML是白血病的主要类型，是最常见的成人急性白血病［2］。自20世纪70年代以来，大多数类型的AML的治疗方式没有改变，AML的低治愈率也没有明显改善［3］。虽然现在小分子靶向治疗、免疫治疗及造血干细胞移植等治疗方式取得了一定的治疗效果，但因高昂的费用而无法普及。因此，寻找普及性高的AML治疗药物是目前的当务之急。

“兰州方”是国家级名中医、中西医结合专家、卫生部突出贡献专家裴正学教授结合几十年治疗经验拟定的经验方，曾治愈一例急性白血病患者，在1974年苏州全国血液病学术会议上经过研讨，被命名为“兰州方”［4］。“兰州方”用于临床多年，但成分复杂，其作用机制仍不清楚。积极探索“兰州方”中的有效成分、作用机制也许能为AML的治疗提供新的启示。

网络药理学是基于多成分和多靶点分析临床疾病有效组合药物的方法，非常适合用来阐明复杂的中药复方对疾病的作用机制［5］。通过计算复方的靶点与疾病相关蛋白的联系，网络药理学可以将复方与疾病的关系呈现出来，为理解复方治疗疾病的机制提供整体框架［6］。从“一种药物，一个靶点”到“多种药物，多个靶点”，网络药理学能充分挖掘复方药物的治疗潜力［7］。

1 资料与方法

1.1 “兰州方”治疗AML的有效成分和靶点及构建网络通过中药系统药理学与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）［8］收集“兰州方”的化合物，化合物纳入标准为生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类 药性（drug likeness，DL）≥0.18［9］，并同时收集化合物的蛋白靶点。基于Disgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病数据库，通过关键词“acute myelogenous leukemia”和“AML”搜索并采集AML疾病相关基因。通过UniProt数据库，将“兰州方”的蛋白靶点转换为基因靶点。在对药物以及疾病的基因靶点取交集后，将共同靶点放入Cytoscape，建立“兰州方”治疗AML的有效成分及对应靶点的网络。

1.2 “兰州方”治疗AML的核心网络构建将共同靶点置入STRING数据库，在得到共同靶点之间相互关系的文件后，将共同靶点相互关系导入Cytoscape软件进行分析。使用CytoNCA插件，计算各个靶点Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、Local Average Connectivity-based method（LAC）、Network（NC）的评分，并筛选出评分大于平均值的靶点构建核心网络［10］。同时，使用CytoHubba插件中的degree模块、maximal clique centrality（MCC）模块和edge percolated component（EPC）模块构建核心网络［11］。

1.3 功能富集分析使用R软件中的“clusterProfiler”［12］“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”包对共同靶点进行基因本体（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，并将富集结果进行可视化处理。

1.4 分子对接为了进一步探索化合物和靶基因之间潜在的直接作用机制，对靶蛋白及对应的化合物进行分子对接。首先，从PubChem数据库获得“兰州方”中有效化合物的mol2结构作为分子对接配体，从PDB数据库中获得AML相关蛋白晶体结构作为受体。然后，使用AutoDock vina对配体和受体进行分子对接，AutoDock vina是一个开源应用，可以实现高效、稳健的分子对接。通常分子结合能≤-5 kcal/mol-1被认为是有效结合，分子结合能越小，表示预测配体和受体结合的能力越强。

2 结果

2.1 “兰州方”治疗AML的有效成分及对应靶点的网络构建通过TCMSP平台，检索了“兰州方”主要药物的化合物成分，包括：生地黄、山药、山萸肉、人参须、太子参、北沙参、党参、五味子、桂枝、白芍、生姜、大枣、炙甘草、麦冬以及浮小麦，其中麦冬和浮小麦没有相关资料，因此未被纳入后续分析。基于OB≥30%及DL≥0.18，筛选到“兰州方”中能被人体口服利用的化合物，并通过与AML疾病相关基因取交集，得到与AML直接相关的有效化合物139种，各种药物含有的化合物以及有效化合物数量见表1。基于Disgenet、Drugbank、NCBI、OMIM、Pharmgkb和TTD疾病数据库，共查询到348个AML疾病相关基因，见图1A。通过取交集，共得到39个“兰州方”作用于AML的靶基因，见图1B。为了更好地展示药物、化合物成分和AML靶基因的相互关系，基于Cytoscape 3.8，将药物、化合物成分及AML靶基因的相互关系进行分析并构建了网络图，见图1C。通过网络图，“兰州方”与AML靶基因复杂的关系能被清晰的呈现。该网络图也清晰呈现了Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶基因数量最多的5种化合物。见表2。

图1 “兰州方”治疗AML的有效成分及对应靶点的网络构建图

表1 “兰州方”中各味药含有的化合物以及有效化合物数量

表2 “兰州方”中治疗AML作用靶基因最多的5种化合物

2.2 “兰州方”治疗AML的核心网络使用STRING数据库，对39个靶基因的相互关系进行分析并保存为TSV格式文件，置入Cytoscape进行分析。基于CytoNCA插件，将临界值设定为BC＞15.73434343，CC＞0.4，DC＞5，EC＞0.103901334，LAC＞2.666666667，NC＞3.466666667，得到8个核心 基 因，包括：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8及PTGS2，见图2A。随后，基于cytoHubba插件，再次通过3种拓扑算法“Degree”“EPC”和“MCC”进行分析，不同算法展示的结果几乎一致，证明了结果的准确性，见图2B-D。

图2 “兰州方”治疗AML的核心网络

2.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析使用GO功能富集分析了39个靶基因的生物学过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF），见图3A。结果显示，其主要富集于：细胞对有毒物质和异生物质的反应、活性氧代谢过程、机体对异生物质的反应及代谢过程等。KEGG通路富集分析显示靶基因主要富集于：铂类药物抵抗、癌症中的miRNA、PI3K-Akt通路、HIF-1通路、癌症中的转录失调、VEGF信号通路、NF-kappa B信号通路。结果中很多通路与肿瘤的发生和发展有关，揭示了“兰州方”治疗AML的潜在机制，见图3B。

图3 “兰州方”治疗AML靶基因的GO与KEGG分析

2.4 分子对接使用AutoDock vina软件模拟分子对接过程。PTGS2被证明是肿瘤发生发展的关键基因之一，之前结果也显示其是“兰州方”治疗AML的核心基因之一，且被多种化合物影响，因此选择PTGS2编码的蛋白COX-2进行模拟分子对接。塞来昔布是COX-2的特异性抑制剂，将它与COX-2的结合作为分子对接的阳性对照。通过PDB网站，查询到COX-2的活性口袋的位置。在确定活性口袋位置后，vina软件揭示塞来昔布能在该位置与COX-2集合，结合能为-11.0 kcal/mol-1，如图4A。在同一部位，笔者发现Kaempferol、Quercetin、Luteolin、naringenin、beta-Caro-tene都能与COX-2结合，结合能分别为：-8.9、-8.8、-8.5、-8.9、-7.5 kcal/mol-1。通常结合能≤-5 kcal/mol-1被认为是有效结合，因此，结果提示“兰州方”中的多种化合物成分与PTGS2等疾病相关靶点有良好的亲和性。见图4。

图4 “兰州方”中有效化合物与AML相关基因PTGS2编码蛋白COX-2的亲和性

3 讨论

“兰州方”是裴正学教授通过多年临床实践拟定的经验方，对AML的疗效得到了普遍认可［13］。“兰州方”中药物成分多达15种，每种药物中又有许多不同化合物，传统方法难以解析其作用机制。本研究基于网络药理学，构建了“兰州方”治疗AML的网络图，探寻了起关键治疗作用的化合物，探究了治疗作用的核心靶点，分析了治疗作用的主要富集功能和通路，并通过分子对接，验证了“兰州方”中小分子化合物与AML关键靶蛋白的相互作用。本研究基于“多种药物，多个靶点”的基本逻辑思路，验证了“兰州方”的有效性和科学性，为“兰州方”的推广应用提供了一定的理论依据。

通过构建“药物-疾病”网络图，笔者发现Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin是作用靶点最多的5种化合物。经过详细查阅文献，笔者发现Quercetin、Luteolin和Naringenin已经被报导过，可能对AML有良好的疗效。CHANG等14］报导 了Quercetin能通 过影 响细胞周期，凋亡和自噬，抑制人白血病HL-60细胞系 的 增 殖。SHI等［15］报 导Quercetin能 通 过VEGFR2和PI3K/Akt通路，诱导AML细 胞凋亡。CHEN等［16］基于结构和虚拟筛选的方法，筛选并验证了Luteolin能够有效抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）相互作用激酶1（mitogen-activated protein kinase-interacting kinase 1，MNK1）。SHI等［17］报导Naringenin可能通过抑制Akt和ERK通路，促进JNK和p53通路，增强curcumin诱导的肿瘤细胞凋亡。然而，Kaempferol、Diosgenin及“兰州方”中的其他化合物没有被验证过对AML有治疗作用。不过有许多研究报导了Kaempferol、Diosgenin及“兰州方”中其他化合物在其他肿瘤里的抗癌潜力，为后续的研究提供了可能的方向［18-19］。

通过cytosnape里的CytoNCA和cytoHubba插件，得到了“兰州方”治疗AML的核心基因，包括：VEGFA、MAPK3、IL1B、STAT3、HIF1A和PTGS2等。目前已经有大量研究报导了这些基因与AML之间的关系。VEGFA是抑制血管生成靶向治疗的主要靶点，对AML的发生发展起关键作用［20］。MAPK3是MAP激酶家族的成员，在信号级联中起重要作用，与众多肿瘤的发生发展有关［21］。白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）是白细胞介素1细胞因子家族成员，是炎症反应的重要介质，参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡，也参与多种肿瘤的发生发展，包括AML［22］。信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族成员，能被相关激酶磷酸化，形成二聚体转移到细胞核中激活转录，在众多肿瘤中都处于高度激活状态［23］。最近，有报导阐述了STAT3在调节肿瘤免疫反应中发挥着核心作用，靶向STAT3已成为许多癌症的潜在治疗策略［24］。缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1 α，HIF1α）作为细胞对缺氧反应的主要调节因子，激活包括能量代谢、血管生产、细胞凋亡相关基因的转录，与众多肿瘤的发生发展有着密切关系［25］。前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成的关键酶之一，负责参与炎症和有丝分裂的前列腺素生物合成，在结直肠癌等肿瘤中，PTGS2被证明是有效的治疗靶点［26］。因此，基于既往的研究，表明“兰州方”可以通过影响多个已被证实的有效靶点治疗AML。

通过对共同靶基因的GO功能富集分析，发现“兰州方”治疗AML的基因功能主要富集在血管生成、活性氧代谢过程、对有毒物质的反应及代谢过程等方面。血管生成和活性氧代谢是肿瘤发生发展的关键表型［27-28］。长期接触有毒物质，特别是在特定的工作或生活环境中，是诱发肿瘤的关键因素之一［29］。本研究结果表明，“兰州方”可能通过影响以上生物学过程，发挥治疗AML的作用。

KEGG富集分析结果表明，共同靶基因的相关通路主要有癌症中的miRNA、PI3K-AKT信号通路，HIF-1信号通路，VEGF信号通路，NF-KB信号通路等。有文献报道中药能够通过影响miRNA的表达量，改变信号通路中关键蛋白的表达，从而治疗肿瘤［30-31］，这与我们的研究相似。PI3K-AKT通路已经被广泛研究，该通路调节细胞增殖、生长、代谢和运动，在癌症发生发展中普遍被激活，大量研究表明抑制该通路可抑制肿瘤的进展［32］。HIF-1信号通路在机体缺氧状态下被激活。HONG等［33］报道，中草药的活性成分能够抑制HIF-1信号通路，进而抑制肿瘤血管生成。VEGF信号通路主导血管生成，抗VEGF信号通路是肿瘤治疗的主要手段之一，有文献报道穿心莲内酯能够通过抑制VEGF信号通路从而抑制乳腺癌发展［34］。NF-κB信号通路参与调节免疫、炎症和细胞生存，是肿瘤发生发展的关键通路。有文献表明，通过抑制NF-κB信号通路，能够抑制肿瘤的发展与抗肿瘤药物耐药性的产生［35-36］。以上多条信号通路涉及炎症、免疫调节、血管生成等，且都与肿瘤发生发展关系密切，我们推测“兰州方”中的活性成分主要通过调节以上多条信号通路发挥治疗AML的作用。

笔者采用分子对接方法验证“兰州方”中的有效成分与AML中的关键靶蛋白的结合能力。PTGS2是核心基因之一，且被“兰州方”中最多的化合物影响，因此笔者选择PTGS2进行分子对接验证。结果证实，多种化合物都与PTGS2的编码蛋白COX2的活性口袋区域具有良好的亲和性，并且进一步说明了“兰州方”通过“多种药物、多个靶点”的综合作用，发挥治疗AML的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，构建了“兰州方”治疗AML的网络图，预测起关键治疗作用 的 化 合 物 为：Quercetin、Luteolin、Kaempferol、Naringenin、Diosgenin；治疗的核心靶点为：MAPK3、STAT3、TP53、VEGFA、HIF1A、IL1B、CXCL8和PTGS2；潜在治疗机制影响的通路包括：PI3KAKT信号通路，HIF-1信号通路，VEGF信号通路，NF-κB信号通路等；并通过分子对接，验证了“兰州方”中小分子化合物与AML关键靶蛋白PTGS2的相互作用；围绕“多种药物，多个靶点”的基本分析策略，验证了“兰州方”的有效性和科学性，为“兰州方”的推广应用提供了一定的理论依据。