基于网络药理学探讨天南星治疗癫痫的作用机制*

李欢，卢玲，廖现秋，何乾超，陈炜，梁霜，刁丽梅△

1广西中医药大学研究生学院,广西 南宁 530001；2广西中医药大学第一附属医院

癫痫是继偏头痛、中风和老年痴呆症之后第四大最常见的神经系统疾病［1］。大约三分之一的癫痫患者对现有的抗惊厥药物不敏感，极易复发，甚至伴有认知功能障碍，给患者及社会增加了极大的负担［2］。据流行病学调查研究显示，中国约有900万例癫痫患者，而且每年约有40万例的新发病例［3］。目前临床上治疗癫痫的主要方法包括病因治疗、抗癫痫药物治疗及非药物治疗。由于癫痫发病机制至今尚未完全阐明，已知的药效靶点较少，因此暂无疗效确切的治疗方案。而中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，在癫痫的治疗和辅助治疗方面具有很大的潜力。

中药天南星（rhizoma arisaematis）临床应用十分广泛，近几年来，多项研究表明中药天南星在治疗癫痫中发挥重要作用。天南星，别名南星，虎掌南星，为天南星科植物天南星、异叶天南星或东北天南星的干燥块茎。始载于《神农本草经》，味苦、辛，性温，有毒，归肺、肝、脾经，具有祛风止痉，化痰散结的功效，主要用于治疗中风痰壅、口眼歪斜，风痰眩晕，顽痰咳嗽等疾病。药理研究表明，天南星具有镇痛、镇静、抗惊厥、抗心律失常、抗肿瘤、抗氧化、祛痰等作用［4］，然而其抗癫痫的具体作用靶点尚不明确。

网络药理学结合了网络生物学和多药理学的方法，是寻找新的分子靶点的一种很有前途的方法。在本研究的框架内，通过对现有数据进行分析，筛选出与癫痫相关的基因。采用网络药理学方法，从“活性成分-药物靶标-通路”水平探索天南星治疗癫痫的潜在新的药物靶点及作用机制，可以为中药单体在临床抗癫痫的研究中提供更有力的依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源本研究使用的相关分析平台和数据库见表1。

表1 相关分析平台和数据库

1.2 对天南星活性成分的检索及筛选本研究借助TCMSP软件，以“天南星”为检索词，检索其活性成分，根据药动力学原理［5］，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为活性成分筛选条件，筛查天南星的主要有效活性成分及其靶标，并将所获得的资料用Excel表格导出。

1.3 天南星作用靶标的获取及收集采用Perl软件对相关有效成分作用靶标进行预测，然后导入物种为“人”的Uniprot数据库查找对应的标准靶标基因名，从而得到天南星活性成分靶标。

1.4 癫痫相关靶标的获取及与天南星预测靶标的映射利用“epilepsy（癫痫）”为检索词，通过Gene Cards数据库、OMIM数据库获取癫痫疾病的相关靶标，删除重复靶标基因。最后将天南星的预测靶标与癫痫相关靶标进行映射，获得天南星与癫痫疾病交集靶标的韦恩图。

1.5 “药物-活性成分-疾病-靶标”网络的构建与分析将“1.3”项获得的天南星治疗癫痫的潜在靶标，输至Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-疾病靶标”调控网络图，通过网络图直观展示中药天南星活性成分与潜在作用靶标之间的关系。

1.6 构建靶标互作网络图（PPI图）及核心靶标的筛选将天南星治疗癫痫的潜在靶标导入STRING数据库并限定研究种类设置为“homosapiens（人类）”，得出蛋白互作网络图，保存为tsv文件，将所得文件输入R语言计算，得到蛋白互作网络核心靶标图。

1.7 GO富集分析与KEGG通路分析把天南星与癫痫疾病交集靶标输入R语言软件进行天南星活性成分治疗癫痫关键靶标基因Gene Ontology（gene ontology，GO）生物过程、KEGG信号通路功能注释富集分析。

2 结果

2.1 天南星活性成分的检索及筛选本研究根据TCMSP平台检索到天南星有效成分123个，相关靶点672个；再将OB≥30%、DL≥0.18对活性成分进行筛选，共获得天南星的主要活性成分7个，包括8、11、14-二十二碳三烯酸甲酯、24-表蛇甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等。见表2。

表2 天南星的活性成分筛选结果（OB＞30%，DL＞0.18）

2.2 天南星成分治疗癫痫的潜在作用靶标预测结果通过TCMSP数据库中的靶标预测，去除重复靶标后得到天南星活性成分作用靶标40个。通过GeneCards、OMIM数据库平台合并去重后获得癫痫疾病靶标4621个。运用R语言软件将与天南星相关靶标和疾病靶标取交集，获得天南星治疗癫痫的靶标的韦恩图，见图1。最终获得共同靶标26个，表明天南星可通过多个靶标发挥治疗癫痫的作用。

图1 中药-疾病靶标

2.3 药物-活性成分-疾病-靶标网络构建本次研究运用Cytoscape 3.7.2进行关系网络绘制分析。结果显示，中药天南星主要通过6种有效成分作用于26个癫痫靶标，这26个靶标基因可能影响癫痫的发生。因此本课题组推测中药天南星治疗癫痫不仅是通过多种中药活性成分作用于不同靶标来实现网络调节效应，还可能通过潜在作用靶标之间的相互影响，进而产生了复杂的调节关系，从而发挥治疗癫痫作用。见图2。

图2 中药-成分-疾病-靶标调控网络

2.4 中药-疾病靶标PPI网络与核心靶标筛选分析结果天南星-癫痫靶标蛋白相互作用网络图见图3。中药-疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为：CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A，见图4。

图3 中药-疾病靶标蛋白相互作用网络

图4 中药-疾病核心靶标的条图

2.5 关键靶标生物功能及通路分析

2.5.1 GO功能富集天南星治疗癫痫的关键靶标富集显著的前10个生物学功能主要为类固醇激素受体活性，核受体活性，转录因子活性，细胞因子活性，细胞因子受体结合，核糖核酸聚合酶二转录因子结合，泛素样蛋白连接酶结合，脱氧核糖核酸结合转录激活活性，激酶调节活性，激活转录因子结合等。表明天南星有效成分可以通过调控多种生物学途径而发挥治疗癫痫的作用，见图5a—5b。

图5 b GO功能富集分析气泡图

图5 a GO功能富集分析柱状图

2.5.2 KEGG通路富集天南星治疗癫痫的关键靶标基因显著富集在细胞凋亡-多种信号通路、乙型肝炎信号通路、含血清素的神经突触通路、人类免疫缺陷病毒1型感染信号通路、p53信号通路、铂耐药信号通路、细胞凋亡信号通路、麻疹信号通路、结肠直肠癌信号通路、小细胞肺癌、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、可卡因成瘾信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、EB病毒感染信号通路、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路等通路上。结果见图6a—6b。

图6 b KEGG通路富集分析气泡图

图6 a KEGG通路富集分析柱状图

3 讨论

癫痫在中医里命名有多种，包括“巅疾”“痫证”或“痫病”等，俗称“羊痫风”或“羊癫风”。《丹溪心法·痫》指出：“痫证有五，无非痰涎壅塞，迷闷孔窍……”故常将“痰气逆乱、窍蒙风动”作为对癫痫病机的概括，以化痰熄风，开窍定痫为基本治则［6-7］。天南星为传统中药，药用历史悠久，作用广泛，常配伍其他中药组方治疗多种疾病。

本次通过TCMSP数据库检索和“药物-活性成分-疾病-靶标”网络的构建分析，筛选出天南星中包括β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等在内的7个主要活性成分及靶标40个，在Gene Cards、OMIM数据库中得到癫痫潜在靶标4621个，与天南星的靶标映射得到天南星治疗癫痫的靶标26个，天南星治疗癫痫的可能关键成分6个。研究表明，天南星的主要活性成分可通过多靶标、多基因影响癫痫的发生，他们之间存在相互协同的关系。天南星治疗癫痫的核心基因主要有CASP3、ADRA1B、JUN、MAOA、CASP8、CASP9、MAOB、PTGS2、SLC6A4、ADRB2、BAX、BCL2、PRKCA、SLC6A2、SLC6A3、OPRM1、PGR、MAP2、AKR1B1、CHRM3、GABRA1、KCNH2、NR3C2、SCN5A。这些基因可能通过影响类固醇激素受体活性，核受体活性，转录因子活性，细胞因子活性，细胞因子受体结合，核糖核酸聚合酶二转录因子结合，泛素样蛋白连接酶结合，脱氧核糖核酸结合转录激活活性，激酶调节活性，激活转录因子结合等来调控癫痫。即主要从炎症因子、细胞因子等分子水平来治疗癫痫。炎症因子可改变神经元兴奋性从而诱发神经元异常放电，而神经元长时间放电会造成神经元细胞及胶质细胞功能失调，最终加速细胞凋亡［8］。Caspase蛋白家族是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，其中Caspase-3在细胞凋亡的执行阶段起关键作用［9］。研究发现，Caspase-3参与癫痫患者颞叶组织的神经细胞凋亡［10］，Caspase-3的升高可导致癫痫患者认知功能下降［11］。凋亡的发生又与凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达密切相关，而这两者的异常表达又直接参与癫痫的病理过程［12-13］。GABRA1是γ-氨基丁酸受体，两者结合可充分发挥神经元兴奋抑制作用，具有镇静、催眠、抗惊厥等功能［14-15］。

根据KEGG信号通路和GO生物过程富集分析结果，发现天南星治疗癫痫的核心基因涉及的KEGG通路众多。富集明显的通路主要包括细胞凋亡-多种信号通路、乙型肝炎信号通路、含血清素的神经突触通路、人类免疫缺陷病毒1型感染信号通路、p53信号通路、铂耐药信号通路、细胞凋亡信号通路、麻疹信号通路、结肠直肠癌信号通路、小细胞肺癌、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、可卡因成瘾信号通路、EB病毒感染信号通路、ALS信号通路、人类巨细胞病毒感染信号通路等通路上。已有相关文献报道凋亡信号通路与癫痫的发展联系密切，凋亡信号通路的异常激活致使神经元凋亡是海马神经元丢失的主要形式之一［16］。腺苷A1R参与了癫痫发作后海马神经元损伤过程，它通过降低腺苷A1R活性，增加谷氨酸兴奋性，最终诱导神经元调亡［17］。田沁涛等［18］通过建立癫痫模型，发现在两边海马CA1区注射anti-GDNF抗体能够降低癫痫发作次数，起到神经元保护作用，其机制可能是抑制了GDNF/RET/P53信号通路。可卡因成瘾信号通路在癫痫中磷酸化水平明显变化，可能与多巴胺受体功能有关［19］。ALS信号通路的改变涉及由Nefh编码的神经纤维细丝蛋白磷酸化的改变，而这个蛋白质则与轴突功能密切相关［20］。上述通路涉及病毒、细菌、细胞凋亡、免疫调节和肿瘤等各个方面。这些通路分别从不同的层面影响癫痫的发生发展。

本研究利用网络药理学对癫痫治疗靶点、天南星的有效成分及作用靶点与机制进行了初步的筛选与分析，为后续针对天南星治疗癫痫的药效物质基础与作用机制的研究提供了依据。此外，本研究存在一些缺点，由于筛选条件的限制，只能分析天南星中主要化合物，所以在一定程度上研究结果具有局限性。另外，虽然通过网络药理学技术能够筛选出大量靶点和通路，但这些结果都有待于通过药理实验进一步验证。