藿香正气丸（浓缩丸）HPLC 指纹图谱

王孟颖，孙福英，赵雯，饶毅，万林春

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西省肿瘤医院，江西 南昌 330029；3.江西中医药大学，江西 南昌 330004

［关键字］藿香正气丸（浓缩丸）；指纹图谱；相似度评价；HPLC

藿香正气丸（浓缩丸）是一种解表化湿药，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第7 册［1］，其中仅收载了性状、显微鉴别等项目，尚无含量限定的相关项目。为更好地控制药品质量，许多研究者对藿香正气系列进行了研究，黄淡霞［2］建立起了藿香正气丸中的厚朴、广藿香等六味药材的TLC 鉴别方法和橙皮苷、厚朴酚的HPLC 含量测定方法。林雀跃等［3］为藿香正气合剂建立了专属的HPLC指纹图谱，最终确定了15个共有峰。陈宗良等［4］使用超高效液相色谱建立了藿香正气水的指纹图谱，并标定了9 个特征峰。但由于各种藿香正气丸的剂型和配方略有不同，因此亟待建立藿香正气丸专属的指纹图谱。本研究组选取4 个具有代表性的生产厂家的16 批藿香正气丸（浓缩丸）进行测定后，建立了HPLC 指纹图谱，并对30 批藿香正气丸（浓缩丸）进行指纹图谱的测定并计算相似度。结果表明相似度良好，能有效控制藿香正气丸（浓缩丸）质量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1260 系列（全自动）高效液相色谱仪，Chemstation 化学工作站，DAD 检测器；Sartorius BSA 124S-CW 电子天平；Sartorius BT 25S 电子天平。

1.2 试剂

甘草苷、异欧前胡素、橙皮苷、甘草酸铵、欧前胡素、和厚朴酚、厚朴酚均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为110610-200604、110827-200407、110721-201616、110731-201418、110826-200712、110730-201614、110729-201513。甘草素、川陈皮素购于上海安谱实验科技股份有限公司，批号分别为T1670010、T3560010。乙腈为色谱纯级，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），按表1程序梯度洗脱；检测波长270 nm；柱温为35℃；流速为 1.0 mL/min。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于5 000。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取藿香正气丸（浓缩丸），于研钵中研细，取粉末约2 g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，用微孔滤膜（0.45 µm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 各含20 µg 的混合溶液，即得。

2.3 测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 µL，进样测定，记录色谱图。以3 号色谱峰（橙皮苷）作为参照。供试品指纹图谱中应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。按中药指纹图谱相似度评价系统计算，供试品与对照指纹图谱的相似度应大于等于0.85。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取藿香正气丸（浓缩丸）（批号：20150614）1 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次。以3 号共有峰（橙皮苷）作为参照峰，计算各色谱峰保留时间的RSD 为0.02%～1.67%，相对峰面积的RSD 为0.02%～1.86%。

2.4.2 重复性实验 取藿香正气丸（浓缩丸）（批号：20150614）6 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定。以3 号共有峰（橙皮苷）作为参照峰，计算各色谱峰保留时间的RSD 为0.04%～1.72%，相对峰面积的RSD 为0.02%～1.92%。

2.4.3 稳定性实验 取藿香正气丸（浓缩丸）（批号：20150614）1 份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 进样测定。以3 号共有峰（橙皮苷）作为参照峰，计算各色谱峰保留时间的RSD 为0.02%～0.75%，相对峰面积的RSD 为0.02%～1.91%。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

选取具有代表性的4 个生产厂家的样品（共16批）建立共有模式，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样测定，图谱导入2012 版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，选取“时间窗宽度”为0.10 min，以“中位数”生成对照图谱，自动校准后，得到藿香正气丸（浓缩丸）的标准对照图谱。见图1。经与对照药材和对照品的色谱峰对比，最终共标定了13 个共有峰，并指认出9个成分，对照品色谱峰见图2～10。参考《中国药典》血脂康胶囊等［5］品种项下指纹图谱的限度与相关文献［6-10］，同时考虑到不同产地原药材成分含量的差异以及不同企业工艺控制水平的差异，暂拟定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度限度为0.85。

图1 藿香正气丸（浓缩丸）HPLC指纹图谱

图2 甘草苷对照品色谱图

图3 橙皮苷对照品色谱图

图4 甘草素对照品色谱图

图5 甘草酸铵对照品色谱图

图6 川陈皮素对照品色谱图

图7 欧前胡素对照品色谱图

图8 和厚朴酚对照品色谱图

图9 异欧前胡素对照品色谱图

图10 厚朴酚对照品色谱图

运用该藿香正气丸(浓缩丸）HPLC 指纹图谱方法，测定了9 个企业的30 批藿香正气丸（浓缩丸），结果显示这30 批样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均高于0.85，结果见表2。

表2 藿香正气丸（浓缩丸）生产厂家、批号及相似度

3 讨论

3.1 检测波长的选择

由于不同的化学结构，不同化学物质的紫外吸收波长各有不同。本研究中确定的9 种化合物的最大吸收波长在254～336 nm 范围内，集中分布于

254～294 nm 波长范围内，为使本实验各峰的响应值都较大，最终确定检测波长为270 nm。

3.2 提取溶剂和提取方法的考察

本研究考察了甲醇、甲醇-盐酸（100∶1）两种提取溶剂和超声30 min、回流1 h 两种提取方法对实验结果的影响。结果显示，不同溶剂、不同提取方式的色谱结果中，各个峰的响应值相当。为使操作更简便，最终确定以甲醇为溶剂，超声提取30 min。

本研究建立了藿香正气丸（浓缩丸）的HPLC指纹图谱，最终共标定了13 个共有峰，并指认出9 个成分，通过2012 版中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，结果表明不同厂家间的药品存在一定差异，这可能是不同的生产工艺、原料来源造成的。通过方法学验证，HPLC 指纹图谱的方法结果稳定、可靠，可以用于藿香正气丸（浓缩丸）的质量控制，HPLC 指纹图谱的建立也为藿香正气丸（浓缩丸）的产品一致性评价提供了参考。