一测多评法同时测定青皮中5 种成分的含量

邝敏贤，潘弟仪，陈用年，刘少君

广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510360

青皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。《中国药典》2020 年版将青皮分为“个青皮”和“四花青皮”两种不同的规格［1-2］。自然掉落于5～6 月的幼果，采集晾干后，俗称“个青皮”；采摘于7～8月份未成熟的果实，在果皮上纵剖成4 瓣至基部，切去瓤，干燥后，被称为“四花青皮”。青皮味苦、辛，性温，具有破气行痰、消痞除满、理气健脾、燥湿化痰等功效，用于治疗胸胁胀痛、疝气疼痛、乳癖、乳痈、食积气滞、脘腹胀痛等病症［3］。如广州中医药大学第三附属医院（以下简称我院）中医外科，医师多利用青皮破气、消痞等功效来治疗妇人乳腺方面的疾病。现代药理研究表明，青皮具有去痰平喘、利胆、调节肠胃功能、抗休克、抗病毒、抗肿瘤及抗氧化等活性［4-6］。青皮主要含有挥发油、黄酮类和生物碱类等成分，其中黄酮类成分主要为橙皮苷、芸香柚皮苷、橘皮素等，是其有效成分。2020 年版《中国药典》一部青皮项下只将橙皮苷作为指标成分，用于对其进行品质的控制［1］。目前国家公示的青皮配方颗粒国家标准中，在特征图谱项下规定了辛弗林、芸香柚皮苷、橘皮素等7个特征峰。说明青皮中至少含有这7 个成分。

一测多评法（QAMS）确定其他成分与内参照物间的相对校正因子（RCF），利用内参照物含量和RCF 可以通过计算得到其他成分的含量，实现对中药材中多个成分的含量结果的同时测定，QAMS 已逐渐应用于中药材和中成药制剂的质量控制中［7-9］。本研究通过建立QAMS，以橙皮苷为内参照物，同时测定青皮中辛弗林、芸香柚皮苷、川陈皮素、橘皮素5 种化学成分的含量，以期进一步优化青皮药材的质量标准，为我院采购和验收青皮药材或饮片及后续院内制剂研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型超高效液相色谱仪（安捷伦）；Waters Acquity 型超高效液相色谱仪（沃特世）；Eco-S15 实验室纯水系统（上海和泰仪器）；Quintix系列分析天平（赛多利斯科学仪器）；SHZ-D（III）型循环水式真空泵；HH-S2 型数显恒温水浴锅。

1.2 试药

橙皮苷（批号：110721-201818，纯度96.2%），辛弗林（批号：110727-201809，纯度99.5%）购自中国食品药品检定研究院。芸香柚皮苷（批号：wkq19041908，纯度≥98%），川陈皮素（批号：wkq20031701，纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司。橘皮素（批号：151021，纯度98%以上）来自成都普菲德生物技术。甲醇、乙腈等纯度为色谱纯（Merck 公司）；甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯；水使用超纯水，其他试剂纯度为分析纯。10 批青皮药材均符合2020 年版《中国药典》一部青皮项下相关规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［3］

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脱（0～2 min，1%→8% A；2～5 min，8%→13% A；5～12 min，13%→19% A；12～13 min，19%→22% A；13～20 min，22%→35% A；20～21 min，35%→51% A；21～30 min，51%→54% A；30～31 min，54%→1% A；31～35 min，1% A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：275 nm；进样量：1 μL。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素和橘皮素对照品适量，置20 mL 量瓶中，加10%甲醇溶解并定容，摇匀，配制成质量浓度分别为540.261 6、23.417 6、53.277 5、21.196 3、17.751 2 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取青皮药材细粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，取出，放冷，再次称定重量，用10%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，加10%甲醇稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图。以对照品的质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得到各待测组分的回归方程及线性范围见表1。可知5 个成分于相应质量浓度范围内线性关系良好。

表1 线性关系考察结果

2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6 次，计算得辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素色谱峰峰面积的RSD 分别为0.73%、0.76%、0.46%、0.32%、0.30%，表明仪器的精密度良好。

图1 专属性考察UPLC色谱图：A.空白溶剂；B.供试品溶液；C.混合对照品溶液

2.4.4 重复性试验 取青皮样品适量，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算得辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素色谱峰峰面积的RSD 分别为1.28%、1.40%、0.46%、1.74%、2.06%，表明该方法的重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取青皮样品适量，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 进样进行测定，计算得辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素色谱峰峰面积的RSD 分别为1.75%、2.48%、1.00%、1.50%、1.08%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性。

2.4.6 加样回收率试验 取同一批次成分含量已知的青皮样品9 份，每份取约0.1 g，分为3 组，每组分别按高、中、低浓度精密加入混合对照品溶液。按“2.3”项下的方法制备得到供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样进行测定，记录各自峰面积，计算各成分的加样回收率及对应的RSD。结果见表2，辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的平均回收率及RSD 分别为101.05%（RSD 2.82%）、96.01%（RSD 2.92%）、96.93%（RSD 1.73%）、94.01%（RSD 2.78%）、103.86%（RSD 2.00%）。表明该方法准确度良好。

表2 青皮中5种成分的加样回收率试验结果

表2 （续）

2.5 相对校正因子的确定［10-11］

精密吸取“2.4.2”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样进行测定，以橙皮苷为内参照物，以各自的峰面积和质量浓度，代入公式计算，得其余4 种成分的相对校正因子（fs/k），公式为fs/k=fs/fk=（As×Ck）/（Ak×Cs），其中As为 内参照物峰面积，Cs为内参照物质量浓度，Ak为待测成分峰面积，Ck为待测成分质量浓度，结果见表3。

表3 各成分相对校正因子

2.6 耐用性和系统适应性研究

2.6.1 不同品牌色谱仪器及色谱柱对相对校正因子的影响［12］以橙皮苷为内参照物，考察其他4 种成分在Agilent 1260 型、Waters Acquity 型两种高效液相色谱系统，以及沃特世ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），安捷伦ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），YMC Triart C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）等三种色谱柱下的相对校正因子（RCF），结果见表4，表明不同色谱系统和色谱柱对各成分RCF 无显著影响。

表4 不同品牌色谱仪、色谱柱对相对校正因子的影响

2.6.2 不同柱温对相对校正因子的影响［12］采用Agilent 1260 型高效液相色谱仪、安捷伦ZORBAX SB-C18 色谱柱，考察柱温设定为25、30、35、40 ℃下对每种成分的相对校正因子的影响，结果见表5，不同柱温条件下4 种成分的RSD 分别为1.48%、1.70%、2.54%、2.62%，均小于3%，表明柱温对4 种成分相对校正因子无显著影响。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响

2.6.3 不同流速对相对校正因子的影响［12］采用Agilent 1260 型高效液相色谱仪、安捷伦 ZORBAX SB-C18 色谱柱，考察流速0.2、0.3、0.4 mL/min 对4 种成分相对校正因子的影响，结果见表6，不同流速条件下4 种成分的RSD 分别为0.94%、1.17%、1.32%、2.76%，表明不同流速对各成分相对校正因子无显著影响。

表6 不同流速对相对校正因子的影响

2.6.4 不同进样体积对相对校正因子的影响［12］采用Agilent 1260 型高效液相色谱仪、安捷伦 ZORBAX SB-C18色谱柱，考察进样体积0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL 对4 种成分相对校正因子的影响，结果见表7，各成分的RSD 分别为0.88%、2.35%、2.55%、1.80%，表明进样体积的波动对各成分相对校正因子无显著影响。

表7 不同进样体积对相对校正因子的影响

2.7 待测成分色谱峰的定位［13］

在一测多评的运用中，能否在不同色谱体系中对待测组分的色谱峰进行准确定位是关键，目前常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差法、时间校正法等。相对保留值法计算公式：ti/s=ti/ts。ti为待测组分保留时间，ts为内参照物保留时间。本实验采用相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，以橙皮苷为内参照物，考察其他4 种成分在Agilent 1260 型和Waters Acquity 型两种高效液相色谱系统，以及3 根不同厂家的色谱柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Agilent ZORBAX SBC18、YMC Triart C18）的相对保留时间。结果见表8，采用相对保留值法各成分的RSD 均小于3%，表明采用相对保留值法对待测成分的定位是可行的。

表8 各成分相对保留时间

2.8 一测多评法与外标法测定结果比较

取10 批青皮适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别采用外标法（ESM）和QAMS 测定5 种成分的含量，利用SPSS 26.0 软件对两组检测结果进行配对t 检验及Pearson 相关性分析。结果见表9，两种方法之间的相关系数r均为1.00，表明两种方法测定结果具有高相关性，且两种方法测定结果无显著性差异（P＞0.05），建立的一测多评法具有较好的可信度。

表9 外标法与一测多评测定结果比较

3 讨论

本研究对供试品溶液的提取方式（超声法、回流法），提取溶剂（10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇、10%甲醇、20%甲醇、50%甲醇），提取时间（30、45、60 min）和稀释体积（20、50、100 mL）进行了考察。结果表明，按“2.3”项下的方法制备得到供试品溶液时色谱峰的峰面积和分离度均较好。在210～400 nm 内对供试品溶液进行扫描，发现在275 nm 时色谱图基线平稳、噪声小，各组分的响应值较高，因此，选择275 nm 作为检测波长。

目前，对青皮的研究主要集中于不同产地、不同规格等方面［3,14-15］。本次实验以我院的常用药材青皮为研究对象，希望能同时测定青皮含有的5 种黄酮类成分。引入一测多评法，实验过程中对测定方法进行方法学考察，比较不同成分的峰面积和质量浓度得到4 种成分与橙皮苷的相对校正因子，还使用外标法来验证了本实验建立的一测多评法的准确性，从而考察一测多评法在青皮5 种黄酮类成分的含量测定上是否具有可行性和可操作性。

结果表明，使用QAMS 测得的青皮5 种黄酮类成分的含量与外标法测定结果没有明显差异，证明建立的一测多评法可行，具有较好的稳定性和准确性。此方法的建立，可使青皮药材从单一成分测定升级为更多成分测定，为更全面地评价青皮药材质量提供了方法。该方法的建立，能大大提高测定速度和降低测定成本，为我院在采购及验收青皮药材或饮片质量控制提供参考。