抗逆转录病毒治疗后人类免疫缺陷病毒感染者CD8+记忆性T 细胞活化与耗竭水平的研究

邱文浩 熊润松 刘 显 伍月榕 肖 健

1.广西中医药大学基础医学院，广西南宁 530022；2.广西中医药大学公共卫生与管理学院，广西南宁 530022；3.广西中医药大学科技处，广西南宁 530022；4.广西中医药大学科学试验中心，广西南宁 530022

人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原体[1]，CD4+T 细胞计数是评价HIV 感染者免疫功能大致水平的重要指标，对于评价抗逆转录病毒治疗（after anti-retroviral therapy，ART）的效果也有重要意义[2]。CD8+T 细胞是抗病毒的主要免疫效应细胞，在控制HIV 复制方面发挥重要作用[3]。免疫应答的后期，存活下来的CD8+T 细胞成为CD8+记忆性T 细胞（memory T cells，Tm）细胞，参与再次免疫应答[4]。由于病毒持续感染，HIV 感染者CD8+T 细胞表面常表现出更高水平的免疫活化分子CD38 和HLA-DR的表达，同时抑制性受体（如2B4）表达也会升高[5]。

本研究通过检测CD8+Tm 细胞活化分子CD38、HLA-DR 和免疫耗竭分子2B4 的表达水平，探讨其对免疫功能的影响，为临床指导用药及新药研发提供新思路和理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2022 年1 月至2 月于广西贵港市疾病防控中心收集了HIV 感染者62 例。纳入标准：符合《中国疾病预防控制中心中国艾滋病诊疗指南（2021 年版）》[6]的诊断标准；排除标准：多种病毒（如乙肝病毒、丙肝病毒）合并感染或其他特殊疾病。根据《艾滋病免疫功能重建不良中西医协同治疗专家共识（2020 版）》[7]，将HIV感染者分为免疫重建完全组40 例（ART 治疗＞4 年，CD4+T 细胞计数≥500 个/μl）[8]，男22 例，女18 例；平均年龄（41.5±13.0）岁。免疫重建不全组22 例（ART 治疗＞4 年，CD4+T 细胞计数＜500 个/μl），其中男12例，女10 例；平均年龄（42.5±14.0）。另外设置12 名健康捐献者为健康组，男6 名，女6 名；平均年龄（40.3±10.0）岁。本研究经医学伦理委员会批准（GXIRB2022-0025），所有研究对象对本研究知情且同意。

1.2 主要仪器与试剂

Attune 流式细胞仪（赛默飞世尔公司）；抗体CD3（货号：555674）、CD8（货号：563256）、CD45RO（货号：560743）、CCR7（货号：353216）、CD62L（货号：304842）、2B4（货号：329536）、CD38（货号：551400）、HLA-DR（货号：561137）购自BD 公司。

1.3 研究方法

取免疫重建不全组、免疫重建完全组与健康组静脉血，与等体积RPMI-1640 混匀，通过淋巴细胞分离液得到外周血单个核细胞；2%FPS 重悬细胞，调节细胞悬液浓度至2×107个/ml；取50 μl 细胞悬液加入EP 管中，加入抗体4℃避光孵育20 min；加入500 μl PBS 混匀后离心弃掉上清液；加入多聚甲醛固定后，流式细胞仪检测[9]。

1.4 统计学方法

通过GraphPad Prism 8.4 软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验；计数资料采用百分率表示，比较采用χ2检验。Pearson 分析相关性。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组CD8+Tm 细胞上CD38 表达量比较

免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞CD38 的表达量均高于健康组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞CD38 的表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1、表1。

图1 各组CD8+Tm 细胞CD38 的表达

表1 各组CD8+Tm 细胞CD38 表达量比较（%，）

表1 各组CD8+Tm 细胞CD38 表达量比较（%，）

注 与健康组比较，aP ＜0.05。Tm 细胞：记忆性T 细胞

2.2 各组CD8+Tm 细胞上HLA-DR 表达量比较

免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上HLA-DR 的表达量均高于健康组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上HLA-DR 的表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2、表2。

图2 CD8+Tm 细胞上HLA-DR 的表达

表2 各组CD8+Tm 细胞上HLA-DR 表达量比较（%，）

表2 各组CD8+Tm 细胞上HLA-DR 表达量比较（%，）

注 与健康组比较，aP ＜0.05。Tm 细胞：记忆性T 细胞

2.3 各组CD8+Tm 细胞上2B4 表达量比较

免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上2B4 的表达量均高于健康组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上2B4 的表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3、表3。

图3 各组CD8+Tm 细胞上2B4 表达量比较

表3 各组CD8+Tm 细胞上2B4 表达量比较（%，）

表3 各组CD8+Tm 细胞上2B4 表达量比较（%，）

注 与健康组比较，aP ＜0.05。Tm 细胞：记忆性T 细胞

2.4 各组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达

免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达量均高于健康组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图4、表4。

图4 各组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达

表4 CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达量比较（%，）

表4 CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的共表达量比较（%，）

注 与健康组比较，aP ＜0.05。Tm 细胞：记忆性T 细胞

2.5 各组CD38+HLA-DR+CD8+Tm 细胞上2B4 的表达

免疫重建不全组和免疫重建完全组CD38+HLADR+CD8+Tm 细胞上2B4 的表达量均高于健康组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+CD38+HLA-DR+Tm 细胞上2B4 的表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图5、表5。

图5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 细胞上2B4 的表达

表5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 细胞上2B4 表达量（%，）

表5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 细胞上2B4 表达量（%，）

注 与健康组比较，aP ＜0.05。Tm 细胞：记忆性T 细胞

2.6 ART 后HIV 感染者CD8+Tm 细胞上各分子表达的相关性

ART 后HIV 感染者CD8+Tm 细胞上CD38 与HLADR 的表达呈正相关（r=0.634 6，P ＜0.05），CD38、HLA-DR 与2B4 间无相关性（r=0.0814、0.1996，P ＞0.05）。

3 讨论

CD8+Tm 细胞是再次免疫应答中的主力军，在面对HIV 攻击时，存活时间更长、反应更强更快[10-11]。因此，深入对CD8+Tm 细胞的免疫功能水平的研究，对于治疗HIV 的慢性感染有着深远意义。

慢性、未经治疗的HIV 感染的特点是病理性免疫激活和炎症状态[12]，尽管ART 有效预防HIV 感染患者的死亡，但免疫重建仍存在问题[13]。CD38 分子可传递活化信号，诱导T 细胞的活化和增殖[14]，而HLADR 是一种晚期激活标志物[15]。HIV 感染进程中，CD8+T 细胞的活化提示T 细胞的高频率更新和免疫耗竭[16-18]，并与感染易感性增加有关，由CD38 和HLA-DR 共同表达确定的CD8+T 细胞活化水平，与AIDS 发病和死亡的风险具有相关性[19-21]。相比之下，低感染表型的特点是T 细胞上HLA-DR 和CD38 的低表达[22]。当通过ART 将血浆病毒血症抑制到几乎检测不到的水平时，免疫激活会减弱，但不会达到健康人群的水平[23]。本研究发现，ART 后HIV 感染者免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的表达水平较健康组均升高，免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR的共表达水平较健康组均升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。同时本研究的相关性分析结果中，ART后HIV 感染者CD8+Tm 细胞CD38 与HLA 的表达呈正相关。这提示尽管接受ART 治疗，HIV 感染者免疫功能得到一定程度的重建，但是CD8+Tm 细胞活化水平依然处于异常升高的状态中，这可能是由于病毒的持续感染导致的。另外，本研究发现ART 后HIV 感染者免疫重建不全组和免疫重建完全组CD8+Tm 细胞上CD38、HLA-DR 的表达量差异均无统计学意义（P ＞0.05），这提示在HIV 的持续感染下，CD8+Tm 细胞活化水平升高已得到证实，但其与CD4+T 计数的关联，尚待进一步探究。

持续的免疫活化会导致免疫抑制受体的高表达，最终导致T 细胞功能耗竭[24]。免疫耗竭分子2B4 在高表达时，会抑制T 细胞免疫功能，在AIDS 后期，2B4上调会通过抑制CD8+T 细胞的效应而导致疾病进一步进展[25]。本研究发现，ART 后HIV 感染者免疫功能重建不全组和完全组CD8+Tm 细胞上2B4 的表达水平较健康组升高；在CD38+HLA-DR+CD8+Tm 细胞即活化的CD8+Tm 细胞上，2B4 的表达水平同样呈现升高的情况。这提示尽管HIV 感染者接受了ART 治疗，CD8+Tm 细胞免疫耗竭水平依然升高，高表达的2B4在一定程度上持续抑制CD8+Tm 细胞的免疫功能；而活化的CD8+Tm 细胞上2B4 表达升高，这提示病毒的持续感染在导致细胞免疫活化升高后，免疫抑制相应升高，最终将导致细胞免疫功能的耗竭。

总之，本研究通过检测ART 后HIV 感染者CD8+Tm细胞上免疫分子的表达水平，得出以下结论：尽管ART 治疗使免疫功能得到一定程度的重建，但是随着HIV 的持续感染，病毒无法被彻底清除，因此CD8+Tm细胞一直保持过度活化的状态，引起免疫抑制升高，最终导致CD8+Tm 细胞的免疫耗竭。