菟丝子-枸杞子对雷公藤多苷诱导精原细胞生精障碍模型增殖、凋亡的影响

王继升 鲍丙豪 邓 省 冯隽龙 李海松

北京中医药大学东直门医院男科，北京 100700

[关键字]菟丝子；枸杞子；男性不育症；增殖；凋亡

男性不育症是指夫妇有规律性生活1 年以上，未采用避孕措施，由于男方因素造成女方无法自然受孕[1]。研究表明，有10%～15%的夫妇面临不孕不育的困扰[2]。中医学认为，肾精亏虚是导致男性生精功能障碍的重要病因[3-4]，而菟丝子-枸杞子药对是临床中常用的补肾填精药物组合，在临床上被广泛用于少弱精子症的治疗[5-6]。

精原细胞是精子生成的基础，本课题组既往研究表明，菟丝子-枸杞子可对精原细胞有修复作用[7-9]。本研究拟观察菟丝子-枸杞子对精原细胞的增殖、周期及超微结构的治疗作用，为补肾填精法治疗男性不育症提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

动物：北京维通利华有限公司提供6 周龄SPF 级雄性SD 大鼠20 只，体重（200±20）g，主要用于含药血清制备，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，动物合格证号：1100111911000582。实验实施、动物喂养均在北京中医药大学东直门医院（以下简称“我院”）重点实验室动物中心进行，饲养条件依照实验室动物标准条件。

细胞：精原细胞购自武汉普诺赛公司（货号：CL-0600），当细胞覆盖率达70%～80%时，按1∶5 比例传代培养，48 h 更换完全培养基。本研究通过我院动物伦理委员会审查（NO：19-27）。

1.2 主要试剂与仪器

雷公藤多苷（批号：130801，每片10 mg），左卡尼汀口服液（批号：130801），菟丝子-枸杞子免煎颗粒剂各15 g，均购自北京康仁堂股份有限公司。细胞凋亡（T2190）、细胞周期（CA1510）、线粒体膜电位（M8650）试剂盒均购自Solarbio 公司。

透射电子显微镜[日本Hitachi HT7700（80KV）]、全自动脱水机（沈阳誉德有限公司SYD-T2070）、石蜡包埋机（沈阳誉德有限公司SYD-B-F）、石蜡切片机（沈阳誉德有限公司SYD-S3020）、离心机（德国Eppendorf 公司Centrifuge 5415D）、超净工作台（中国东联FLC-3 型）。

1.3 含药血清制备

采用随机数字表法将20 只大鼠分为空白组、雷公藤多苷组、左卡尼汀组、药对组，每组5 只。分别予以去离子水[10 ml/（kg·d）]、雷公藤多苷[40 mg/（kg·d）]，左卡尼汀口服液[0.2 g/（kg·d）]、菟丝子-枸杞子药对[0.45 g/（kg·d）]灌胃，每天上午10 点灌胃，连续7 d，末次灌药的2 h 后麻醉，腹主动脉采血，取血清备用。

1.4 分组及干预

将细胞随即分为四组：空白组、模型组、左卡尼汀组、药对组，取对数生长期细胞接种到6 孔板中，每孔2 ml 完全培养基，接种密度为每孔2×105个细胞，24 h后更换相应培养基干预，具体如下：空白组予完全培养基，模型组、左卡尼汀组、药对组首先用10%雷公藤多苷灌胃大鼠含药血清制备生精功能障碍模型[10-11]，随后左卡尼汀组、药对组再分别予以左卡尼汀、菟丝子-枸杞子10%含药血清干预。每个实验组设6 个复孔，培养24 h 后收集相应细胞用于检测。

1.5 细胞凋亡检测

弃去原培养液，冷PBS 洗涤细胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，离心机离心（1 000 g，4℃，10 min），调整细胞浓度为1×106个/ml。加入500 μl Binding Buffer，1 000 g 离心5 min 后弃上清，再加入100 μl Binding Buffer 混匀后，分别加入5 μl AnnexinV-FITC 与10μlPI，室温25℃避光反应25min，最后加入Binding Buffer，轻轻混匀后上机检测。

1.6 细胞周期检测

弃去原培养液，冷PBS 洗涤细胞2 次，用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，离心机离心（1 000 g，4℃，10 min）。加入1 ml PBS 重悬细胞，1 000 g 离心3 min，弃上清。加入500 μl PI/RNase 染色液，25℃避光孵育15 min 后上机检测。

1.7 线粒体膜电位检测

对数生长期的细胞待其完全贴壁后吸去上清液，PBS 洗涤细胞，在6 孔板中加入1 ml 细胞培养基及1 ml JC-1 染色工作液，充分混匀后于37℃细胞培养箱孵育20 min，弃去上清，每孔加入1 ml JC-1 染色缓冲液洗涤细胞3 次，最后弃上清，加入PBS 重悬细胞后上机检测。

1.8 透射电镜观察细胞超微结构

含药血清干预各组细胞48 h 后，弃培养基，先用PBS 冲洗2 遍，胰酶消化后加PBS 重悬细胞后移至EP 管，1 000 g 离心5 min 后，弃上清，收集细胞团块，加入2.5%戊二醛，4℃冰箱过夜固定，随后脱水、切片，透射电镜下观察。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验；计数资料采用例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡率比较

与空白组比较，模型组细胞凋亡率显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，药对组细胞凋亡率显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1、图1。

表1 各组细胞凋亡率比较（%，）

表1 各组细胞凋亡率比较（%，）

注 与空白组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bbP ＜0.01

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.2 各组细胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比较

与空白组比较，模型组细胞的G0/G1和G2/M 期百分率显著降低、S 期百分率显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与模型组比较，药对组细胞的G0/G1和G2/M 期百分率显著升高、S 期百分率显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表2、图2。

表2 各组细胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比较（%）

表2 各组细胞G0/G1、S 和G2/M 期百分率比较（%）

注 与空白组比较，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；与模型组比较，bbP ＜0.01

图2 流式细胞仪检测各组细胞周期

2.3 各组细胞线粒体膜电位比较

与空白组比较，模型组细胞中线粒体膜电位显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，药对组细胞中线粒体膜电位显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表3、图3。

图3 流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位

表3 各组细胞线粒体膜电位比较（%，）

表3 各组细胞线粒体膜电位比较（%，）

注 与空白组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bbP ＜0.01

2.4 四组精原细胞超微结构损伤情况

空白组细胞的各细胞器形态结构正常，模型组细胞膜大面积破裂，细胞基质大面积密度减低，空泡变。细胞内众多细胞器损伤，如细胞核形状变形严重，局部凹陷；线粒体重度肿胀变形，嵴断裂；粗面内质网明显扩张；高尔基体肥大。左卡尼汀组和药对组细胞膜结构完整，细胞基质大面积密度正常。细胞核形状饱满；线粒体结构完整；粗面内质网、高尔基体结构正常。见图4。

图4 电镜观察细胞器超微结构

3 讨论

菟丝子-枸杞子药对是补肾填精常用中药组合，近年来有多项研究证明，菟丝子-枸杞子药对可从多方面改善精子质量[12-14]。细胞周期是亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所需的时间，其对于生精细胞的正常与否起到关键作用[15-16]。细胞周期由4 个阶段组成，G0/G1期细胞处于DNA 复制过程之前；S 期细胞处于正在进行DNA 的复制，但是整个DNA 复制过程并没有全部完成；G2/M 期细胞已经完成了DNA 复制过程[17]。本研究中，课题组发现菟丝子-枸杞子含药血清干预后精原细胞G2/M 期比例明显升高且细胞凋亡率明显下降，提示菟丝子-枸杞子药对含药血清可能通过调节细胞周期的变化进而改善雷公藤多苷损伤的细胞。

本实验结果提示，菟丝子-枸杞子药对含药血清可以改善线粒体膜电位水平同时修复线粒体及其他细胞器损伤。线粒体功能正常对于调控细胞周期和增殖具有重要作用[18]。作为细胞内生成腺苷三磷酸的主要场所，线粒体是促进细胞能量转换的重要细胞器。线粒体膜电位耗损可严重影响线粒体功能，引起细胞凋亡率增加，线粒体膜电位是反映线粒体功能的重要指标[19-21]。在人类精子中，线粒体主要位于精子鞭毛中段，所产生的腺苷三磷酸为精子前向运动提供了必要的能量供应[22-24]。精子线粒体膜电位与精子活力、存活率和受精能力呈正相关，线粒体膜电位的下降意味着精子活动所必需的能量供应合成障碍，引起精子活力下降及生精细胞凋亡增加[25-28]。

综上，本研究从线粒体膜电位、细胞周期与凋亡等方面入手，利用雷公藤多苷诱导生精功能障碍模型。研究发现菟丝子-枸杞子可以有效修复雷公藤多苷诱导的细胞超微结构损伤，抑制其凋亡，这可能与其调节精原细胞周期、改善细胞线粒体膜电位有关，但其具体作用机制仍有待进一步深入研究。