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药桑叶具α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性部位筛选及酶动力学研究

2022-12-24贺水花宋毅李海平曹慧敏杨玲

塔里木大学学报 2022年4期
关键词:水相糖苷酶桑叶

贺水花 ,宋毅,李海平 ,曹慧敏 ,杨玲*

(1塔里木大学生命科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)

(2塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室,新疆 阿拉尔 843300)

2021年,全球大约有5.37亿20—79岁的成年人患有糖尿病[1],糖尿病已成为当今严重和常见的慢性疾病之一。近年来,从中草药资源中寻找降糖效果好,且对机体无副作用的新型天然植物α-葡萄糖苷酶抑制剂逐渐成为研究热点之一[2-4]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过抑制小肠内糖苷酶活性,延迟消化摄入的碳水化合物从而减少葡萄糖的吸收来控制血糖水平[3]。研究α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制机制,对于α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发及应用具有重要的理论和实践意义。

药桑作为一种药食同源性植物[5],是维吾尔族的民间降血糖药物[6-7]。郝蒙蒙等[8]研究发现药桑叶中提取的粗黄酮、粗多糖和粗生物碱均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,且粗生物碱及高浓度的粗多糖抑制活性较强;王贺[9]优化了药桑叶生物活性物质提取纯化工艺的6个单因素条件,按优化工艺所提取纯化的粗生物碱、粗多糖和粗黄酮的α-葡萄糖苷酶抑制活性表现为粗生物碱>粗多糖,与郝蒙蒙的研究结果一致。查阅文献,目前尚未有关于药桑叶的α-葡萄糖苷酶动力学机制研究,本试验基于α-葡萄糖苷酶-pNPG体外反应体系探究了药桑叶提取物不同活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制效果,并采用莱恩威弗-伯克(Lineweaver-Burk)模型对抑制活性较好的部位进行具体的酶动力学研究,将为药桑叶的α-葡萄糖苷酶抑制剂药用开发提供试验数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药桑叶采自新疆和田(79°92'E,37°12'N),由塔里木大学邱爱军副教授鉴定为药桑(Morus nigraL.)的植物叶。

阿卡波糖片(50 mg/片),德国拜耳医药有限公司;α-葡萄糖苷酶(酵母源),江苏瑞阳生物科技有限公司;对硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG)、对硝基苯酚(p-Nitrophenol,PNP),上海麦克林生化科技有限公司;所有萃取使用的有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

酶标分析仪(配有405 nm滤光片),南京德铁实验设备有限公司;电热恒温水浴锅(配有384个EP管插孔),北京市永光明医疗仪器有限公司;CP224C电子天平,美国奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 药桑叶各活性部位的制备

将采集的药桑叶自然阴干后取5 kg碾碎,80%乙醇室温浸提,间歇性搅拌,浸提3次,每次24 h,将所得滤液浓缩,真空冷冻干燥得到粘稠状药桑叶粗浸膏;取1 kg粗浸膏混悬于5 L蒸馏水中,按混悬液∶萃取剂为1∶1的比例,根据萃取剂极性由小到大的次序将混悬液依次萃取3次,得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和剩余水相部位,真空冷冻干燥各萃取部位备用。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶的抑制活性筛选

结合微孔板法[10],参照王贺[9]研究方法,以pNPG为底物的酶-抑制剂筛选模型略加改动,测定药桑叶不同活性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。本试验设置空白组、实验组以及背景组,其中实验组包括阿卡波糖对照组,每组6孔。为使试验结果更为可靠,调整各组浓度使其抑制率曲线均通过50%。剩余水相部位,粗浸膏,正丁醇萃取部位,阿卡波糖浓度梯度均为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL;乙酸乙酯萃取部位,石油醚萃取部位浓度梯度均为0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL。按照表1准确移取0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 6.8),适宜浓度梯度样品(使抑制率曲线过IC50为宜),1.25 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL EP管中后震荡混匀,37℃温育15 min后加入2 mmol/L pNPG,反应20 min,加入0.2 mol/L Na2CO3终止反应。移取200 mL反应终止液至96微孔板中于405 nm[11]处测定各吸光度值(A)。每个处理组各重复3次,取各组吸光度平均值代入公式(1)计算α-葡萄糖苷酶抑制率:

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制体系 μL

1.3.3 标准曲线的绘制

以α-葡萄糖苷酶-pNPG酶促体系有色产物PNP作标准曲线,分别取浓度为0 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL、80 μmol/mL、100 μmol/mL、200 μmol/mL、300 μmol/mL、400 μmol/mL、1 000 μmol/mL PNP溶液各 50 μL,加入 0.2 mol/L 的 Na2CO3400 μL,涡漩混匀,在405 nm下测定吸光度值,纵坐标为吸光度值,横坐标为PNP浓度,分析可得线性回归方程。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用动力学实验

1.3.4.1 酶促反应初速率时间范围测定

按照1.3.2的方法测定2.0 mmol/L pNPG溶液在不同酶活力(0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL、2.0 U/mL)条件下的酶促反应初速率。测定方法为每隔2 min测定一次反应体系吸光度值,以酶反应时间为横坐标,PNP的吸光度值为纵坐标,使用Origin软件进行拟合得到酶反应进程曲线,拟合曲线中产物PNP匀速增加阶段对应的时间范围即为酶的初速率时间范围。

1.3.4.2 剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶抑制类型的研究

在1.3.4.1测定的初速率时间范围内,考察剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶活力的影响,以酶活力为横坐标,反应初速率为纵坐标作图,根据抑制动力学曲线特点判断其可逆或不可逆抑制类型[12]。反应体系中各物质浓度为剩余水相部位0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL,pNPG 2.0 mmol/L,α-葡萄糖苷酶0.8 U/mL、1.0 U/mL、1.2 U/mL、1.4 U/mL、1.6 U/mL、1.8 U/mL。

测定样品浓度为0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL,α-葡萄糖苷酶活力为1.8 U/mL,pNPG浓度为1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L、16 mmol/L的反应初速率。以pNPG浓度的倒数为横坐标,反应初速率的倒数为纵坐标,绘制Lineweaver-Burk曲线,通过二次作图,得出剩余水相部位与α-葡萄糖苷酶的解离常数为KSI(抑制剂浓度与斜率作图,所得直线与横坐标交点的绝对值)及剩余水相部位与α-葡萄糖苷酶-底物复合物的解离常数为KII(抑制剂浓度与截距作图,所得直线与横坐标交点的绝对值),根据Lineweaver-Burk曲线特征及KSI、KⅡ大小判断其具体抑制类型,分析其抑制作用机制。

1.4 数据统计分析

使用Origin 2018及SPSS 25.0软件进行数据处理分析及作图,得到相应的半抑制浓度(IC50),显著性检验采用单因素方差分析(Duncan)法,P<0.05。

2 结果与分析

2.1 PNP标准曲线

使用Origin作图并得到线性回归方程y=0.054+0.855x,r2=0.999 4,如图1所示。

图1 PNP标准曲线

2.2 药桑叶各活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性筛选

由图2分析可知,药桑叶各活性部位对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,在实验浓度范围内,质量浓度升高,抑制效果增强。

图2 药桑叶各活性部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

由图3可知,以IC50(抑制50%酶活性所需的抑制剂浓度,IC50值越小,抑制作用越强)为评判标准,药桑叶不同活性部位的半抑制率表现为阿卡波糖萃取部位(0.214±0.020)mg/mL>剩余水相部位(0.394±0.030)mg/mL>正丁醇萃取部位(0.527±0.02)mg/mL>粗浸膏(0.532±0.038)mg/mL>石油醚萃取部位(0.736±0.051)mg/mL>乙酸乙酯萃取部位(1.17±0.051)mg/mL;除正丁醇萃取部位与粗浸膏无显著差异外,其余各组抑制活性均差异显著。其中,剩余水相部位的抑制活性最强,但弱于阿卡波糖。

图3 药桑叶各活性部位的半抑制率及显著性分析

2.3 剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的抑制类型

根据2.2的筛选结果,剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的抑制效果较好,故针对此活性部位进行酶动力学研究,来阐明剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的抑制机制。

2.3.1 酶活力初速度时间范围确定

由图4可知,0.8~2.0 U/mL酶活力的酶促反应各进程曲线在4~14 min进行线性拟合,r2均达到0.999,呈匀速增加状态,故确定初速率测定采样时间范围为4~14 min。

图4 不同活力α-葡萄糖苷酶的酶促反应动力学进程曲线

2.3.2 剩余水相部位可逆或不可逆抑制类型的确定

由图5可知,剩余水相部位浓度为0.0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL时,α-葡萄糖苷酶活力的抑制动力学曲线均通过原点,且0.4 mg/mL的剩余水相部位比0.0 mg/mL,0.2 mg/mL对应的动力学曲线的斜率低,反应初速率减小,可判断剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶抑制类型为典型的可逆抑制。

图5 剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶活力的抑制动力学曲线

2.3.3 剩余水相部位竞争性、非竞争性、反竞争性和混合型抑制类型的确定

由图6a可知在此实验条件下,剩余水相部位浓度越高,其对应的双倒数曲线的横截距越小,纵截距越大,所有直线在第二象限相交,可判断该动力学曲线符合线性混合型抑制动力学曲线的特点[13],抑制剂浓度增高,酶反应的最大反应速率(Vmax)降低(纵截距为),米氏常数(Km)升高。

由图6b、图6c可知,KSI为0.04 mg/mL,KII为0.29 mg/mL,KII>KSI,属于混合型抑制中的竞争抑制作用大于非竞争抑制作用类型[14],具体动力学参数如表2所示。根据此种抑制类型的底物-酶-抑制剂机理,分析可知剩余水相部位可同时通过两种途径来调控产物葡萄糖的产量,主要以与游离α-葡萄糖苷酶结合的方式来抑制α-葡萄糖苷酶对底物pNPG的水解,减少产物葡萄糖的生成;其次剩余水相部位也能与α-葡萄糖苷酶-底物复合物结合,延长产物葡萄糖的生成时间,从而可达到延缓血糖升高的目的。

图6 剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶具体抑制类型曲线分析结果

表2 剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数

3 结论与讨论

本试验通过对药桑叶各活性部位进行较为系统的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选,结果表明:以IC50值为比较标准,对α-葡萄糖苷酶抑制活性大小为阿卡波糖>剩余水相部位>正丁醇萃取部位>粗浸膏>石油醚萃取部位>乙酸乙酯萃取部位;活性较强的剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为线性混合型抑制,且其竞争抑制作用大于非竞争抑制作用,表明药桑叶剩余水相部位对α-葡萄糖苷酶的亲和力比酶的正常底物pNPG大,主要是以与游离α-葡萄糖苷酶结合的方式来延缓α-葡萄糖苷酶对底物pNPG的水解。本试验为扩大药桑药用部位及其药用资源的进一步开发利用提供理论依据。

前人对药桑的研究主要集中在药桑葚、药桑枝、药桑叶中的乙酸乙酯相与正丁醇相的研究,通过本试验初步探究得知药桑叶醇提浸膏经萃取液依次萃取后的剩余水相部位体外α-葡萄糖苷酶抑制效果较好,有必要进一步探究其生物活性物质的具体化学成分,研究主要的α-葡萄糖苷酶抑制活性单体化合物及化合物之间的协同效应,并进行体内降血糖实验,以期制备出纯度高、效果佳、用量少的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂。

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