蓼子朴核型分析

王波，胡超越

（塔里木大学生命科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

蓼子朴(Inula salsoloidesOstenf.)为菊科(Asteraceae)旋覆花属(Inula)多年生草本植物，在新疆、内蒙古、青海东部和北部、甘肃、陕西、河北、山西北部和辽宁西部均有分布。蓼子朴常作为伴生植物出现于沙生系列和盐生系列过渡的群落中，其可以适应于干旱环境并作为固沙植物，具有一定的药用价值［1］。

染色体倍性在植物遗传育种方面具有重要意义，目前主要有直接鉴定法和间接鉴定法两种方法［2］。王荣邦等［3］通过对菊花染色体倍性的研究，指出染色体计数法是众多倍性鉴定方法中最可靠的一种。STEBBINS G L［4］在 1971 年根据某一物种染色体的长度比和臂比，将核型分为12种，1A属于对称性最高类型，而4C则属于对称性最低的类型，不同的核型代表着物种的进化程度，在分类学上一般核型是由1A→4C进化。每一种生物都具有不同核型，且染色体核型在一定程度上决定物种进化历程，同时核型是说明种系的最好标准。蓼子朴作为塔里木盆地周边常见的植物，具有抗旱、抗虫、抑菌等特点，因此对蓼子朴的深入研究有可能可以解决沙生植物驯化栽培从而降低沙漠化等生态问题，为进一步确定其进化程度及遗传工程等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

塔里木盆地周边的蓼子朴于野外取样，水培后获得新根根尖备用。蓼子朴取材有两个环境相似的地点，分别为新疆维吾尔自治区阿拉尔市迎宾路安然国墓园（40°30'41.90"N，81°17'23.73"E）和南口农场加工厂（40°30'37.83"N，81°18'11.76"E）。

1.2 方法

1.2.1 药品配制

霍格兰营养液：称取霍格兰氏营养液1.936 g于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解并分装，115℃高压灭菌30 min后备用。

卡诺固定液配方：无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，4℃保存备用。

0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液：称取0.29 g 8-羟基喹啉加入蒸馏水定容至1 000 mL，4℃保存备用。

1%秋水仙素溶液：称取1 g秋水仙素粉末溶于少量无水乙醇，加蒸馏水定容至100 mL，4℃保存备用。

2%纤维素酶：称取0.4 g纤维素酶粉末溶于20 mL蒸馏水，4℃保存备用。

2%果胶酶：称取0.4 g纤维素酶粉末溶于20 mL蒸馏水，4℃保存备用。

醋酸洋红：量取45 mL冰醋酸，加入55 mL蒸馏水，煮沸后缓慢加入1 g洋红，搅拌均匀后加入1颗铁锈钉，煮沸10 min冷却后过滤并贮存在棕色瓶内，4℃保存备用。

龙胆紫：量取30 mL冰醋酸加热到40℃，加入0.75 g龙胆紫，溶解后加入70 mL蒸馏水，过滤后4℃保存备用。

希夫试剂：称取0.5 g碱性品红溶于100 mL热蒸馏水中，待溶液冷却至50℃时过滤，再冷却到25℃时加入1 mol/L的盐酸10 mL和1 g亚硫酸氢钠(NaHSO3)，放置暗处静置24 h后，加0.25～0.50 g活性炭摇荡1 min后过滤，溶液呈无色，装入棕色瓶中塞紧瓶塞，保存于冰箱内(0～4℃)备用。

1.2.2 水培蓼子朴

植物根尖的获取有扦插取材、水培取材、种子萌发取材等方法［5］。本试验则采用水培的方法，从野外挖取长势良好的蓼子朴，用黑色塑料袋包裹、保持水分，拿回室内用自来水洗净根部，用遮光的容器进行水培［6］。培养大约7 d，当蓼子朴的新根长出2～5 cm时，切取长势良好的根尖备用。

1.2.3 染色体制片

不同植物有丝分裂最旺盛的时间可能不同，一般植物有丝分裂最旺盛的时间大约在11：00［7］。本试验选取10：00、11：00、12：00、13：00 这4个时间段进行制片观察，以确定有丝分裂最旺盛的时间。

预处理及固定。本试验设置4种预处理方法：低温预处理（将蓼子朴根尖放在4℃冰箱冷藏过夜）；秋水仙素处理（1 g/L秋水仙素溶液，处理2～3 h）；8-羟基喹啉处理（0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液，处理4～5 h）；秋水仙素和8-羟基喹啉协同预处理（秋水仙素处理2 h后再使用8-羟基喹啉处理4 h）。预处理后的根尖使用卡诺固定液固定24 h，经不同浓度的酒精梯度处理，于70%酒精中保存备用。

解离使用酸解和酶解两种方法。酸解：将根尖置于小试管内，加入1 mol/L盐酸溶液没过根尖进行处理，并置于60℃水浴中分别解离7 min、9 min、11 min筛选最佳解离时间，解离后的根尖用蒸馏水冲洗数次（每次蒸馏水停留30～60 s）至无盐酸残留，再置于蒸馏水中备用。酶解：将根尖放入小试管中，加入2%纤维素酶和果胶酶混合液在37℃进行解离，分别解离0.5 h、1 h、1.5 h，筛选最佳解离时间，解离后的根尖用蒸馏水清洗备用［8］。

染色体制片方法。在试验过程中选用了3种染色剂比较染色。龙胆紫或醋酸洋红制片法：十字压片法制片后，打开两个载玻片、材料面朝上、迅速滴1滴龙胆紫（或醋酸洋红）染色3～5 min后，盖片观察［9］；孚尔根染色体制片：取根尖放入小离心管，避光染色大约0.5 h，再加入漂洗液洗掉多余染液，切取蓼子朴根尖紫红色部位，并使用45%醋酸溶液进行盖片观察［10］。

1.3 核型分析

1.3.1 统计染色体数目

在低倍镜下找到染色清晰、染色体无重叠的细胞，再用100倍油镜观察，并使用NIS-Elements viewer软件进行拍照和图片初步处理。在显微镜下统计蓼子朴形态数目清晰的30个有丝分裂中期细胞的染色体，进行染色体计数。

1.3.2 绘制核型模式图

使用 Photoshop CC(2015.0.0版)处理图片［11］；CorelDRAW X7(17.6.0.1021版)处理制作矢量图片并进行测量［12］。

选择染色体数目和形态清晰的细胞。使用CorelDRAW X7平行度量工具和Adobe Photoshop C C标尺工具对染色体的长臂、短臂以及总长进行测定，所获得的数据使用Microsoft Office Excel软件进行分析；用Photoshop软件抠图，整理成为染色体形态图［13］。核型模式图的绘制需要借助Microsoft Office Excel软件进行，主要过程如下：单元格格式设定、插入并调整图表横纵坐标、图表格式的设定［14-15］。

1.3.3 染色体和核型分类的综合描述

参考KUO S R等［16］研究方法整理得到染色体分类表（如表1），染色体核型分类表（如表2）。

表1 染色体分类表

表2 Stebbins G L（1971）核型分类表

2 结果与分析

2.1 蓼子朴的水培根尖形态

塔里木盆地周边的蓼子朴于野外取样，带回室内进行水培。如图1所示，从左至右水培时间依次为水培7 d（图1a）、14 d（图1b）、30 d（图1c）的效果，观察到将蓼子朴培养7 d后可以长出新根，随着培养时间的增长，蓼子朴的新根也越细并且越多。培养14 d的蓼子朴，新生根较粗较多，易于染色体制片，因此培养14 d的蓼子朴根尖最适用于核型分析。

图1 不同培养时间蓼子朴的水培根尖形态

2.2 制片方法筛选

2.2.1 有丝分裂最旺盛时间的筛选

如图2所示，发现12：00（图2c）取材的根尖分裂能力较强，含有较多分裂期的细胞，因此后续试验材料均在12：00时进行预处理和固定。

图2 不同取材时间染色体制片效果分析

2.2.2 预处理方法筛选

4种预处理方法效果如图3所示，结果发现8-羟基喹啉单独预处理时的效果最佳，细胞分散程度很高，背景清晰而且中期染色体较多（图3a）。秋水仙素预处理效果次之，后续试验采用8-羟基喹啉单独预处理的方式进行。

图3 不同预处理方法筛选

2.2.3 蓼子朴根尖细胞解离时间筛选

酸解效果如图4所示，结果表明解离9 min的蓼子朴新根根尖效果最佳（图4b）；而解离7 min的蓼子朴根尖细胞分散度不够高、细胞聚集在一起（图4a）；解离11 min的根尖细胞过于分散，一个视野内细胞数量很少（图4c）。

图4 蓼子朴根尖细胞酸解效果图

酶解效果如图5所示，分别为酶解0.5 h(图5a)、酶解1 h(图5b)、酶解1.5 h(图5c)、酶解0.5 h后再使用盐酸室温解离10 min(图5d)效果，由此可知单独酶解1 h的效果最好，而酸解、酶解共同使用的效果次之。综合分析，由于酸解时间为9 min时解离效果好，后续试验均采用酸解9 min进行染色体制片。

图5 蓼子朴根尖细胞酶解效果图

2.2.4 染色剂筛选

不同染色剂的效果如图6所示，结果发现希夫试剂染色效果较好，背景清晰，对细胞核着色能力很强，但染色时间较长，且需要避光进行（图6a）；醋酸洋红染色仅需要3～5 min，一般情况下，经过醋酸洋红染色的细胞分散程度都比较好，但对染色体的着色能力却比较低（图6b）；龙胆紫染色液的效果较为理想，该染色剂对染色体亲和能力很高，经过染色后可以清晰地分辨染色体的数目和形态（图6c）。综上所述，龙胆紫为本试验染色体染色的最佳染色剂。

图6 不同染色剂对根尖细胞染色效果图

2.3 染色体数目及形态特征

经大量试验后，挑选细胞分散度高、染色体数目清晰的图片，至少统计30个含清晰有丝分裂中期细胞的染色体。通过分析染色体的数目，基本确定塔里木盆地周边的蓼子朴染色体数目为2n=2x=16（如图7，箭头指示随体）。

图7 蓼子朴染色体图(100×油镜观察)

2.4 染色体相对长度及核型分析

通过对5张清晰的蓼子朴染色体图片的测量分析、配对，并绘制核型模式图，染色体参数如图8、表3所示。

表3 蓼子朴染色体参数表

图8 蓼子朴染色体形态图及核型模式图

按KUO S R等［16］分类标准，蓼子朴染色体可分为4种不同类型：第1对和第2对染色体为长染色体组（L）、第3对染色体属于中长染色体组（M2）、第4对和第5对以及第6对染色体属于中短染色体组（M1）、第7对和第8对染色体为短染色体组（S），蓼子朴染色体的相对长度组成为2n=16=4L+2M2+6M1+4S。

按照 LEVAN 等［17］（表 1）分类标准，核型公式为K(2n)=2x=16=14m(2SAT)+2sm，在16条染色体中有14条中着丝粒染色体（m），2条近中着丝粒染色体(sm)，第1对染色体上有随体存在。最长染色体与最短染色体的比值为2.41，臂比值范围在1.07～2.88之间，12.5%的染色体臂比值大于2，在核型分类上属于2B，核型不对称系数（AS.K%）为53.94%。

3 讨论

核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小及形态特征的总和，不同植物具有不同的核型特征，对某一物种进行核型分析则有利于该种的分类研究与进化分析［19-20］。根据STEBBINS G L［4］的核型进化理论，蓼子朴属于由对称向不对称过渡的核型，在进化上较为原始，这也与蓼子朴常作为伴生成分出现于沙生系列和盐生系列过渡群落中的特征相吻合。本试验结果得到蓼子朴为二倍体核型，这一结果可能为蓼子朴通过遗传学的方法改变倍性来完成驯化提供理论依据。前人研究表明，对称性核型向不对称性核型发展是植物界核型进化的基本趋势，而臂比值与核不对称系数能够反映植物的进化程度，本研究发现，蓼子朴核型不对称系数为53.94%，表明蓼子朴核不对称性较小、进化程度较低。另外，蓼子朴染色体类型由m和sm两种组成，且大多数染色体类型为m，可以看出大部分染色体的着丝点集中在中部区域，反映了蓼子朴的染色体比较明显的表型特征。

本试验蓼子朴群落核型一致，但并未观测到清晰的减数分裂期细胞，染色体的倍性还需要进一步确认。在CCDB数据库中对旋覆花属植物染色体有较多的报道［21］，这些植物存在单倍体和二倍体两种倍性，且有近一半的物种具有16条染色体，除染色体基数为9的物种是单倍体外，其余物种均为二倍体，因此旋覆花属植物在染色体水平上的演化可能是以二倍体为主的。本试验虽然获得了较多清晰的含中期染色体的图片，但能分辨染色体缢痕和随体等的图片较少，要获得更多蓼子朴染色体形态特征，还需要更多的研究或辅以其它染色体分析技术，比如染色体带型分析和减数分裂制片以及植物染色体的银染技术等［22-24］。蓼子朴分布广泛，大多生长在比较干旱、高盐碱的环境中，分析确定蓼子朴的核型和染色体数目，有助于为阐明蓼子朴对极端环境的适应性研究奠定基础。本研究旨在为蓼子朴提供更多的染色体数据和核型特征，为进一步的研究提供理论依据。

4 结论

在蓼子朴前期的培养过程中，发现水培大约14 d的根尖最适合进行染色体制片。对蓼子朴进行染色体制片，结果表明在其他条件一致的情况下，发现8-羟基喹啉单独预处理时的效果最佳，细胞分散程度很高，背景清晰而且中期染色体较多；龙胆紫染色液的效果较为理想，该染色剂对染色体亲和能力很高，经过染色后可以清晰地分辨染色体的数目和形态。通过对蓼子朴进行核型分析，结果表明蓼子朴染色体数目是2n=2x=16，染色体相对长度由2n=16=4L+2M2+6M1+4S组成，蓼子朴核型公式为K(2n)=2x=16=14m(2SAT)+2sm，最长染色体与最短染色体的比值为2.41，臂比值大小在1.07～2.88之间，12.5%的染色体臂比值大于2，在核型分类上属于2B，且核型不对称系数（AS.K%）为53.94%。对蓼子朴进行核型分析以确定其倍性、染色体数目等核型特征，为进一步确定其进化程度及遗传工程等奠定理论基础。