萝卜叶不同萃取物对乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

王乐　黄明远　高品一　刘学贵

摘要 [目的]研究萝卜叶不同萃取组分对乙酰胆碱酯酶的抑制活性。[方法]通过对萝卜叶水提原液、水提不同萃取组分及萃取后的水相进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测试，对萝卜叶抑制乙酰胆碱酯酶能力进行评价。[结果]以石杉碱甲为对照，萝卜叶不同萃取物对乙酰胆碱酯酶的抑制能力从大到小依次为石杉碱甲、二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分、石油醚组分、正丁醇组分、水相、萝卜叶水提原液。[结论]萝卜叶具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，并呈现一定的浓度依赖性。

关键词 不同萃取组分；乙酰胆碱酯酶；抑制活性；萝卜叶水提原液；水相

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）01-0120-02

Study of Inhibitory Activity of Different Extracts from Radish Leaves to Acetylcholinesterase

WANG Le， HUANG Mingyuan， GAO Pinyi， LIU Xuegui*

（College of Pharmaceutical and Biological Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang， Liaoning 110142）

Abstract [Objective] To study inhibitory activity of different extraction fractions from radish leaves to acetylcholinesterase. [Method] The inhibitory activities of different polarities of water extracts from radish leaves to acetylcholinesterase were determined and the ability of radish leaves inhibiting acetylcholinesterase was evaluated. [Result] Using huperzine as the control， the order of inhibiting ability from strong to weak is huperzine， dichloromethane layer， ethyl acetate layer， petroleum ether layer， butanol layer， waterphase， radish leaf extract . [Conclusion] Radish leaves have a good inhibitory activity to acetylcholinesterase and present a concentrationdependent manner.

Key words Different extraction fractions；Acetylcholinesterase；Inhibitory activity；Radish leaf extract；Waterphase

蘿卜（Raphanus sativus L.）古汉语中又称莱菔、雹突、菜头等，始载于《唐本草》，是生活中常见的蔬菜，为十字花科萝卜属1～2年生草本植物[1]。萝卜根部为主要的食用部位；萝卜叶又名莱菔叶、萝卜缨，其缨叶性味甘苦平，主要功能消食理气[2]。化学分析证明，萝卜叶的主要成分是精油和多种维生素，还含微量元素和抗病毒成分[1-2]。

在生物体内，乙酰胆碱酯酶（AChE）是以一种蛋白质为结构的生物催化剂，在神经传导过程中起关键作用，能降解乙酰胆碱，使得神经递质在突触后膜上失去活性，从而保证信号的正常传导。AChE在体内一般有6种不同的分子形式，包括3种球形与3种胶原尾样亚基连接形成的不对称形式，其主要在肝脏中合成，AChE在人体的红细胞、内皮细胞、胸腺细胞、肝细胞甚至在骨细胞中广泛表达[3]。乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）一般是从天然产物中提取出来的，主要为生物碱类、萜类、酚类等[4]。在天然产物中分离提取AChEI目前已经成为医药研究的重点[3-6]。笔者通过对萝卜叶水提原液、水提不同萃取成分及萃取后的水相进行乙酰胆碱酯酶抑制活性研究，旨在为发现天然乙酰胆碱酯酶抑制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。

白萝卜叶产于辽宁省沈阳市，经鉴定为萝卜的叶子。

1.1.2 主要仪器。

电子天平TD5102（余姚市金诺天平仪器有限公司），ZF-20D暗箱式紫外分析仪（巩义市予华仪器有限责任公司），Biotek Synergy2多功能酶标仪（基因有限公司），薄层色谱展开缸（上海信宜仪器厂制造），HZC 超声波清洗器（福州志科学仪器公司），UV-3200PC紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），RE-5205旋转蒸发器（上海亚荣有限公司）。

1.1.3 主要试剂。

二甲基亚砜（DMSO，博迪化工股份有限公司），乙酰胆碱酯酶（AChE，北京索莱宝科技公司），PBS粉末（北京索莱宝科技公司），石杉碱甲对照品（北京索莱宝科技公司），二硫二硝基苯甲酸（DTNB，北京索莱宝科技公司），碘代硫代乙酰胆碱（ATCI，北京索莱宝科技公司），其他化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 萝卜叶不同萃取组分的制备。

将4 kg干燥的萝卜叶放在恒温水浴锅中，设置温度为20 ℃，加8 L蒸馏水，浸泡水解18 h；提取3次，减压浓缩，得到浓缩液4 000 mL。取1 000 mL浓缩液，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇1 000 mL萃取3次，萃取完毕，旋蒸，挥干，制得4个不同极性萃取组分的浸膏，待用[5]。

1.2.2 样品溶液的配制。

将萝卜叶中不同萃取组分加入不同剂量的0.1% PBS-DMSO溶液分别配制成浓度为2、100、400、800 μg/mL的样品储备液，待用。

1.2.3 其他溶液的配制。

1.2.3.1

PBS缓冲液的配制。

将PBS粉末通过定容配制成pH 7.4、0.1 mol/L的PBS缓冲液。

1.2.3.2

P-D溶液的配制。

量取10 μL二甲基亚砜至15 mL的EP管中，加入9.99 mL PBS缓冲液，配制成P-D溶液。

1.2.3.3

DTNB的配制。

称取40 mg DTNB加入无水乙醇将其配制成10 mmol/L的溶液，将溶液保存在4 ℃环境中。

1.2.3.4

底物ATCI的配制。

准确称取43 mg ATCI加入无水乙醇将其配制成15 mmol/L的ATCI溶液。

1.2.4 活性测试试验。

1.2.4.1 原理。

由于碘代硫代乙酰胆碱在AChE的作用下能够分解生成碘代硫代胆碱，碘代硫代胆碱与显色剂（DTNB）反应生成5-巯基-2-硝基苯甲酸，而生成的5-巯基-2-硝基苯甲酸能够在405 nm下具有紫外光吸收的黄色物质[5]，反应原理方程式见图1。

1.2.4.2 步骤。

主要采用改良的酶标仪法（Ellman法[6]）对萝卜叶不同萃取组分进行测试，步骤主要在于样品组、样品本底组以及对照组之间通过检测其吸光度值来观察乙酰胆碱酯酶抑制活性。

样品组：在96孔酶标板上中依次加入140 μL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液、20 μL样品溶液、15 μL 0.4 U/mL AChE，在4 ℃条件下反应20 min。加入10 μL 15 mmol/L底物ATCI，再加入20 μL 10 mmol/L DTNB，在37 ℃条件下反应30 min，用酶标仪在405 nm处测定其吸光度值，每组试验做3次平行试验。

样品本底组：用15 μL PBS缓冲液代替15 μL AChE溶液，其他条件不变。

空白对照组：用20 μL PBS缓冲液代替20 μL样品溶液，其他条件不变。

完全抑制对照组：用20 μL PBS缓冲液配制石杉碱甲溶液（0.1 mg/mL）。

抑制率=[（空白组-完全抑制组）-（样品组-样品本底组）]/（空白组-完全抑制组）×100%，各组值均为吸光度值。

2 结果与分析

萝卜叶经过水提取以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚组分、二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分、正丁醇组分、萝卜叶水提原液、水相和石杉碱甲7个样品溶液。对这7个样品分别进行乙酰胆碱酯酶抑制活性检测[7]。

由图2可见，萝卜叶不同萃取组分样品均表现出一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性，且其乙酰胆碱酯酶抑制活性与其样

品浓度均表现出一定的浓度依赖关系。在样品浓度梯度较

低时，抑制率随着浓度增加近似为线性关系， 而浓度较大时抑制率趋于稳定。其中二氯甲烷组分具有相对最强的AChE抑制活性，对其相关数据进行分析得其IC50为344.02 μg/mL。 乙酸乙酯及石油醚组分对AChE也表现出较好的抑制活性，且呈明显的线性相关， IC50分别为369.27、371.12 μg/mL。正丁醇组分的AChE活性相对较弱。萝卜叶水提取原液及水相的AChE抑制效果不佳。

根据7个样品的抑制曲线，确定各样品的IC50值（表1）。结合图2和表1可以确定，7个样品的抑制能力从大到小依次为石杉碱甲、二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分、石油醚组分、正丁醇组分、水相、萝卜叶水提原液。但参考阳性对照石杉碱甲，发现萝卜叶水提取物各萃取组分的乙酰胆碱酯酶抑制活性相对偏低。

3 结论

对萝卜叶中不同萃取组分及其AChE抑制活性进行研究，以石杉碱甲为对照品，对萝卜叶中6个不同萃取组分的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行试验。结果表明，6个组分样品均表现出一定的AChE抑制活性，其AChE抑制活性与其样品浓度均表现出一定的浓度依赖关系。由6个不同萃取组分样品的IC50值可知，其抑制AChE的活性从大到小为二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分、石油醚组分、正丁醇组分、水相、萝卜叶水提原液。由此可见，萝卜葉具有较好的AChE抑制活性，同时为萝卜叶中AChE抑制活性成分的跟踪分离提供试验依据。

参考文献

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[2] 郑一美，周福富.莱菔叶的药效应用及有效成分的提取分离研究[J].亚太传统医药，2008，4（11）：49-50.

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