阿克苏地区部分规模化猪场猪圆环病毒3型的感染情况调查

2022-12-24莫绍江孙鹏亮李虎刘祥杰李莲瑞

塔里木大学学报 2022年4期

莫绍江，孙鹏亮，李虎，刘祥杰，李莲瑞 *

（1塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300）

（2塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV），是已知最小的动物病毒之一，为单链环状DNA病毒，长度2 000 bp，粒子大小在17～20 nm之间。有二十面体的对称结构，无囊膜，对外界的理化环境具有较强的抵抗能力［1-4］。PCV按其基因型的差异分为四种类型，即 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4，其中 PCV2和PCV3是最具感染力和致病力的两型［5］。据报道PCV3比PCV2对仔猪的致病力更强［6］。PCV3感染猪群可引起猪群全系统的炎症反应，严重者可导致母猪流产［7］。由于PCV2病毒已被广泛研究，国内关于PCV2的疫苗早已普遍应用于各个猪场，使用之后大大降低了PCV2的感染率［8］，因此本次研究以PCV3为主。任敏等［9］通过对新疆PCV3的全基因组进行测序并分析，发现所得的PCV3分离毒株与美国报告的毒株同属于3b亚群，首次证实了新疆规模化猪场中已经存在PCV3感染的情况。魏其［10］通过对新疆最具代表性的13个地区进行牛PCV3的分子流行病学调查和基因特征分析，发现PCV3已在新疆地区牛养殖场中广泛存在。前人对新疆株PCV3Cap基因序列研究虽然相对较多，但关于阿克苏地区PCV3感染情况的研究鲜有报道，所以本研究对新疆阿克苏4个规模化猪场的能繁母猪、仔猪和育肥猪的采样样本进行PCV3检测，以期知晓新疆阿克苏地区PCV3感染与流行情况，为该地区PCV3感染防控工作打下理论基础。

1 试验材料

1.1 样品来源

2020—2021年对新疆阿克苏地区4个规模化猪场的能繁母猪、仔猪和育肥猪共采584份全血样本，详情见表1。

表1 样本列表

1.2 试验试剂

表2 试验试剂

1.3 试验仪器与设备

表3 仪器与设备

2 试验方法

2.1 样品的预处理

吸取抗凝管中的全血样品1 000µL加入到1.5 mL无菌离心管中，编号后置于-20℃冰箱保存备用。

2.2 猪圆环病毒3型DNA提取

按照EasyPure®Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书对全血样本总DNA进行提取，并将提取到的DNA放入-20℃冰箱保存备用。

2.3 猪圆环病毒3型PCR扩增检测

引物选取参照王雪涛等［11］研究结果，由上海生工生物股份有限公司合成，引物序列和反应体系及扩增条件见表4、表5。

表4 PCV3 PCR引物序列

表5 PCV3 PCR反应体系及扩增条件

2.4 琼脂糖凝胶电泳

配制1%的琼脂糖凝胶，用PCV3(Cap)-F/R PCR扩增产物点样，设置电压（120 V）、电流（110 mA）、时间（25～30 min），使用凝胶成像系统于电泳后拍照保存。

2.5 PCR产物回收与纯化

将PCV3(Cap)-F/R PCR扩增基因片段的凝胶，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明操作，对扩增基因片段的凝胶进行切胶回收，将回收的目的基因置于-20℃冰箱保存备用。

2.6 PCV3 Cap基因序列测定及同源性分析

使用纯化后的PCR产物送上海生工测序，利用DNAStar软件，将PCR产物测得的序列与GenBank选取的国内15株PCV3Cap基因参考序列进行同源性比对，参考序列见表6。

表6 PCV3 Cap基因参考序列

3 结果

3.1 临床样品中PCV3 PCR扩增结果

以新疆阿克苏地区4家规模化猪场采集的584份猪全血样本的DNA为模板，采用PCV3Cap基因的特异性引物，利用PCR进行PCV3Cap基因的扩增，共测出44份阳性样本，扩增的目的条带与预期大小一致，部分电泳图见图1。

图1 部分样本的PCV3 Cap基因PCR扩增检测结果

3.2 PCV3 Cap基因序列同源性分析

在NCBI上对测序结果进行比对分析，将44份阳性样本PCR产物测序后进行同源性比对，获得2种PCV3Cap基因序列，分别命名为AKesuCap-1（育肥场）和AKesuCap-2（繁育场）。通过DNAStar软件对2种检测出的PCV3Cap基因序列与15株国内流行株Cap基因序列进行同源性比较，并制作PCV3Cap基因同源性表（图2）及基因系统发育进化树（图3）。

图2 PCV3 Cap基因序列与国内毒株核苷酸同源性分析

图3 PCV3 Cap基因序列与国内毒株的系统发育进化树分析

将AKesuCap-1（育肥场）、AKesuCap-2（繁育场）和15株中国PCV3Cap基因参考序列构建同源性表及基因系统发育进化树分析发现，AKesuCap-1和15株中国PCV3Cap基因参考序列的同源性在98.9%～100%之间，且与CN/Xinjiang-AK16/2018株同源性达到了100%，反映了该育肥场存在CN/Xinjiang-AK16/2018毒株感染的情况。同时，AKesuCap-2和15株中国PCV3Cap基因参考序列的同源性介于98.5%～99.6%之间，与NWHEB21、PCV3-CN-ZJ-QZ-2-2017同源性为99.6%。而且，AKesuCap-1和AKesuCap-2同源性为98.5%。由此可知，2株PCV3Cap基因核苷酸序列与国内15株PCV3Cap基因参考核苷酸序列具有高度同源性。而基因系统发育进化树则揭示了AKesuCap-1（育肥场）和AKesuCap-2（繁育场）具有明显的遗传距离，AKesuCap-1与CN/Xinjiang-AK16/2018（MK562412.1）属于同一分支，AKesuCap-2与 NWHEB21（MG564174.1）在同一分支上。

3.3 PCV3感染情况调查

3.3.1 2020—2021年样品中PCV3感染情况

经过对2020—2021年新疆阿克苏地区4个规模化猪场的584份样本进行PCV3检测，共检出PCV3阳性样品44份，总阳性检出率为7.53%。

3.3.2 不同类型猪场PCV3感染情况

通过PCR技术对来自不同猪场的共584份样品进行PCV3检测，结果显示，繁育场PCV3平均阳性率为14.07%（19/135），而育肥场（1、2和3）平均阳性率为5.57%（25/449）。经过对比可以发现，繁育场的PCV3检出率较育肥场要高，详情见表7。

表7 不同类型猪场PCV3检测情况

3.3.3 不同生长阶段的猪群PCV3感染情况

不同生长阶段的猪群对PCV3的感染情况不同，能繁母猪和仔猪的感染阳性率分别为9.09%和17.50%，而育肥猪（1、2、3）的感染阳性率分别为3.33%、5.14%和7.79%。由此可知仔猪的PCV3感染阳性率最高，其次是能繁母猪，育肥猪最低，详见表8。

表8 不同生长阶段的猪群PCV3 PCR抗原检测情况

4 讨论

PCV3是近些年来新发现的一类猪圆环病毒，自2016年在美国报道后，其逐渐在世界范围内传播开来［12-13］。中国作为全球最大的猪肉生产和消费大国也有PCV3的相关报道［14］。阿克苏地处我国西部边陲，通过对该地区四个规模化养猪场展开调查，发现PCV3各猪场阳性发生率为100%，平均阳性率达7.53%，表明该地区的养猪场已经普遍存在PCV3感染。

通过数据分析可知，阿克苏地区部分猪场PCV3阳性率结果与李静等［15］研究结果相比要更低，推测可能与样品来源的差异有关。所有阳性数据中，仔猪阳性率最高，育肥猪阳性率最低，且能繁母猪和仔猪的PCV3阳性率要高于育肥猪群。这与黄翠琴等［16］研究结果一致。

通过对44份阳性样本PCR产物测序进行同源性比对分析，得到2种PCV3Cap基因序列。测序结果表明，AKesuCap-1、AKesuCap-2和15株中国PCV3Cap基因参考序列同源性较高，且与2018年QIAO M F等［17］在新疆阿克苏地区商品猪场所发现的PCV3毒株相一致，推测可能PCV3的Cap基因在当地进化具有相对稳定性，要想进一步证实，还需要开展更广泛的针对PCV3的研究。