p90核糖体S6激酶2——治疗三阴性乳腺癌的潜在靶标

徐丽秀，李佳妮，孙继红，卞金磊，李志裕*

（1. 中国药科大学药学院，江苏 南京 211198；2. 南京圣和药业股份有限公司，江苏 南京 211135）

目前，乳腺癌发病率在女性恶性肿瘤中最高。其中，三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）作为一种特殊的乳腺癌类型，以雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均为阴性而得名，约占乳腺癌的10% ～ 20%[1]。相较于其他的乳腺癌，TNBC具有高侵袭性、易复发、易转移、预后差等特点。TNBC由于其特殊的分子表型，对内分泌治疗不敏感[2]；常规的术后辅助放化疗疗效较差，残留的转移病灶最终会导致肿瘤复发。近几年，TNBC的系统性治疗获得了突破性进展[3]。对于程序性死亡蛋白配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）阳性且无相关禁忌症的晚期TNBC患者，美国FDA于2019年批准阿替利珠单抗联合白蛋白紫杉醇作为一线治疗方案，并于2020年批准帕博利珠单抗联合吉西他滨等化疗药物用于PD-L1高表达的患者。2020年，FDA批准sacituzumab govitecan用于乳腺癌转移后，至少接受过二线治疗的晚期TNBC患者。对既往接受过化疗的胚系BRCA1/2（胚系乳腺癌易感基因）突变的晚期TNBC患者，推荐使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂，如奥拉帕利和talazoparib。越来越多的研究成果证明：确切的分子靶标是治疗TNBC的关键。

研究人员对200多例TNBC病人样本进行组织研究发现：约85%的TNBC组织中，p90核糖体S6激酶（RSK）2处于活化状态，而使用RSK2抑制剂能有效抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导癌细胞凋亡[4]，因此目前认为RSK2是治疗TNBC的具有潜力的靶标。本文将综述RSK2在癌症发生发展中的作用及其抑制剂的研究进展。

1 p90核糖体S6激酶的结构与功能

1.1 p90核糖体S6激酶结构

RSK是一种高度保守的激酶，其结构包括2个功能不同的激酶结构域：一个氨基末端的激酶结构域（NTKD）和一个羧基末端的激酶结构域（CTKD），中间的疏水连接区域将这2个激酶结构域连接，N端和C端分别有一个尾巴[5]。CTKD主要负责RSK的自磷酸化作用，而NTKD主要负责底物的磷酸化作用[5]。RSK家族有4种不同的亚型——RSK1 ～ 4，它们的结构高度同源，差异主要在NTKD；由于N端负责底物的磷酸化作用，所以RSK1 ～ 4功能各异[6]。现有的研究表明：RSK1和RSK2具有原癌基因的特性，促进癌细胞的生长、繁殖，而RSK4具有抑癌基因的特性，RSK3的作用尚存在争议[3-5]。

1.2 p90核糖体S6激酶参与的信号通路和激活机制

RSK是Ras-Raf-MEK-胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路下游的一个信号分子[3-5]，RSK可以被活化的ERK1/2和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide dependent kinase 1，PDK1）直接磷酸化并激活，并且不受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的干扰，如图1所示。

图1 RSK参与的信号通路Figure 1 RSK-related signaling pathways

RSK的活化是通过连续的磷酸化过程完成的[3-5]。第一步，Ras-Raf-MEK-ERK信号通路在丝裂原、激素、神经递质的刺激下被激活，活化的ERK1/2直接结合到C末端尾巴的KIM基序上，使C末端的Thr573磷酸化，CTKD激活。研究证明KIM基序是ERK1/2结合和作用的必需结构。同时，活化的ERK1/2也可以使中间连接区域的Ser363和Thr359磷酸化。第二步，活化的CKTD通过自磷酸化作用使中间连接区域上的Ser380活化。第三步，活化的Ser380为PDK1提供了一个结合位点，PDK1结合以后，使NTKD上的Ser221磷酸化，RSK完全活化。第四步，PDK1和ERK1/2从活化的RSK上释放，以利于RSK的核易位。

RSK2通过磷酸化信号通路下游的多种底物，参与多种生理过程[7]，包括细胞的存活[8]和凋亡[9]、细胞转录[10]和翻译后蛋白质修饰[11]以及细胞周期的调控[12]（见表1）。

表1 RSK2下游的信号分子及其作用Table 1 Signaling molecules downstream of RSK2 and their functions

1.3 p90核糖体S6激酶2的生物学功能

越来越多的研究表明，RSK2的异常激活与癌症的发生、发展密切相关。

1.3.1 调控细胞存活和凋亡Ras-Raf-MEK-ERK通路是最重要的细胞存活信号通路之一[8]，RSK2作为该通路的下游效应分子，在细胞存活中起着至关重要的作用。RSK2介导的信号通路涉及促凋亡蛋白Bad的磷酸化和失活[9]。同时，RSK1和RSK2能通过磷酸化作用，使DAPK失活[13]，从而抑制其促凋亡功能。RSK2还能够直接抑制凋亡蛋白酶体caspase-8的活性[21]，从而促进细胞存活。

1.3.2 调控细胞周期现有研究表明，RSK2对细胞周期的调控是通过磷酸化与细胞周期检查点相关的介质完成的。RSK2通过促进cyclinD1表达[22]，将细胞周期阻滞在G1期；通过维持细胞性骨髓细胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）的稳定[15]，促进细胞周期由G2期向M期进展；同时RSK2也被证明可以磷酸化并激活细胞周期分裂蛋白CDC25A和CDC25B（cell division cycle）[16]，这2种磷酸酶参与了周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases 1，CDK1）的激活，从而促进G2期向M期过渡。

1.3.3 调节转录和翻译过程研究发现，RSK2可调节多种转录因子，包括CREB[12]、血清反应因子（serum response factor，SRF）[23]、ER-a[24]、ETV1（ETS家族成员之一，ETS是目前最大的转录调节因子家族）[25]和NF-κB[10]等。RSK2通过磷酸化CREB和ER-a促进转录过程；RSK2磷酸化ETV1，并直接与其辅助因子——CREB结合型共激活蛋白（CBP）结合、增强CBP功能，从而促进转录过程；此外，RSK2促进NF-κB激活[10]从而促进转录过程是通过磷酸化并抑制NF-κB抑制蛋白（IκB）[23]来实现的。

除促进转录过程外，RSK2还能通过磷酸化核糖体相关蛋白来调控翻译过程。RSK2可磷酸化PI3K/AKT通 路 下 游 的TSC-2[26]。TSC-2与mTOR相关[27]，并促进mTORC1信号转导、翻译和细胞生长。RSK2还能够磷酸化真核翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor，EIF）4B[28]，从而促进帽依赖性翻译。同时，RSK2直接磷酸化RPS6的Ser235/236位点[29]，从而促进翻译起始复合物的组装，增加了帽依赖性的翻译。RSK2还能通过磷酸化并抑制GSK3β来调节基因表达和蛋白质合成[30]。GSK3β磷酸化下游信号分子并抑制其与DNA结合，因此，抑制GSK3β可以刺激下游信号的转录潜力。

2 p90核糖体S6激酶2在三阴性乳腺癌中的作用

Ras-Raf-MEK-ERK信号通路在多种癌症中处于异常激活状态[31]，RSK2作为其下游的信号分子，已被证实与多种恶性肿瘤的发生发展相关，包括TNBC[32]、肺癌[33]、前列腺癌[34]、头颈部细胞癌[35]和血液系统恶性肿瘤[27]。

研究人员对200多例TNBC样本进行组织研究发现：约85%的TNBC组织中RSK2处于活化状态，RSK2的mRNA及蛋白表达水平显著升高，且RSK2的表达量与患者的生存率呈负相关[36]。TNBC细胞对传统的化疗药物应答不佳，且与普通的乳腺癌细胞相比，TNBC细胞对RSK2抑制剂BI-D1870更敏感，BI-D1870能有效抑制MDA-MB-231 TNBC细胞的增殖[37]。利用siRNA分别使SUM149 TNBC细胞中RSK1、RSK2和RSK1/2沉默，结果显示，与对照组相比，沉默RSK2对SUM149细胞的抑制效果最强，沉默RSK1/2次之，而沉默RSK1抑制效果最弱，提示RSK2与TNBC之间密切相关[38]。

2.1 抑制乳腺癌肿瘤干细胞

RSK2保护癌细胞的机制尚不完全明确。有研究表明，RSK2与乳腺癌之间的密切联系与Y盒结合蛋白-1（Y box-binding protein-1，YB-1）相关[39]。YB-1蛋白是一种致癌转录因子，同时也是RSK2下游的底物，RSK2磷酸化其s102位点并导致其激活，通过磷酸化作用使CD44（又称Pgp-1）表达增加。CD44是第1个被作为乳腺癌肿瘤干细胞表面标志物的蛋白[40]，而在TNBC中，肿瘤起始细胞（tumor initiating cell，TIC）的占比高于普通的乳腺癌类型，这可能是乳腺癌易复发的原因之一。研究发现，使用RSK2抑制剂BI-D1870可降低CD44的表达[38]，且靶向抑制RSK2或敲除其基因能有效抑制小鼠体内的肿瘤生长。TIC表征为CD44+/CD24-，其形成与CD44密切相关。研究结果表明在TNBC中，抑制RSK2能抑制磷酸化YB-1（p-YB-1）、降低CD44的表达，从而抑制TIC形成[41]。

2.2 调控细胞增殖

RSK2调控肿瘤细胞的增殖是通过激活各种转录因子以及与翻译相关的核糖体蛋白来实现的。RSK1和RSK2可磷酸化CREB的Ser133位点，导致其激活[12]。CREB是一种对细胞增殖、分化和生存至关重要的核转录因子，其下游的c-fos转录激活[42]，在肿瘤的发生发展过程中也起到重要作用。在Ras-Raf-MEK-ERK信号通路激活的TNBC细胞中，RSK2调节eIF4B和RPS6的磷酸化[43]，以及程序性死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）的水平。PDCD4是一种肿瘤抑制因子，与eIF4A相互作用，抑制蛋白质的翻译，RSK2磷酸化PDCD4并促进PDCD4蛋白降解，从而解除其翻译抑制作用[44]。也有研究认为，RSK2介导的ELK3对c-fos启动子活性的增强作用，在肿瘤细胞的基因转录和翻译中发挥重要作用。ELK3是ETS转录因子家族的成员，当其被Ras介导的MAPK信号通路激活时，具有反式激活子的作用[45]。

2.3 调控细胞凋亡

最近有研究报道，内质网应激下，乳腺癌细胞中RSK2被激活，并通过诱导自噬来保护癌细胞免受内质网应激诱导的凋亡[46]。长时间的内质网应激会导致细胞凋亡，而自噬可以通过减轻内质网应激，减少凋亡从而保护癌细胞[47]。RSK2通过结合并磷酸化腺苷一磷酸（AMP）活化的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）α2，触发自噬，减轻内质网应激从而保护癌细胞。靶向RSK2也许能够通过减轻内质网应激下的自噬，调控癌细胞凋亡。在乳腺癌中，RSK2对细胞凋亡的调控可以通过磷酸化促凋亡蛋白Bad实现[48]，RSK2直接磷酸化Bad蛋白上的Ser112位点使其激活，增强其与14-3-3蛋白结合的能力，阻止抗凋亡蛋白Bcl-2（B-cell Lymphoma-2）和BCL-xL（B-cell Lymphoma-xL）形成二聚体，凋亡蛋白家族形成的二聚体可以作为细胞凋亡信号通路上的分子开关，抑制细胞凋亡从而保护乳腺癌细胞[49]。RSK2调控细胞凋亡也可以通过磷酸化caspase-8实现，caspase-8是一种半胱氨酸蛋白酶，通过与Fas相关死亡域蛋白（Fas-associating protein with a novel death domain，FADD）形成死亡诱导信号复合物（DISC），诱导细胞凋亡，RSK2使其失活从而抑制细胞凋亡[50]。

2.4 调控细胞周期

RSK2可以上调cyclinD1的表达[22]。CyclinD1是一种周期蛋白，能够将细胞阻滞在G1/M期，并且RSK2抑制剂能有效抑制乳腺癌细胞系中cyclinD1的表达却不影响正常细胞[51]。RSK2也能通过介导CDK1的磷酸化状态促进细胞周期由G2/M进展，CDK1通过WEE1激酶和髓鞘转录因子(myelin transcription factor 1，Myt1)维持在非活性状态，随后WEE1激酶磷酸化CDK1的Tyr15位点，Myt1磷酸化CDK1上的Thr14位点，从而导致CDK1激活[52]，细胞周期由G2期向M期进展。WEE1的磷酸化和失活由ERK介导，Myt1的磷酸化和失活由RSK介导。

3 在研的p90核糖体S6激酶2抑制剂

3.1 SL0101

SL0101作为第1个RSK特异性抑制剂，为RSK多种生物学功能的分析提供了一个强大的工具。SL0101与ATP竞争性结合到RSK的NTKD并发挥抑制作用，但它却无法区分RSK的4种亚型[53]。SL0101不仅能在分子水平上抑制RSK激酶的活性[54]，在完整细胞中也显示出对RSK激酶的特异性。当ATP浓度为10 μmol · L-1时，SL0101在体外激酶实验中抑制RSK2的IC50值为1 μmol · L-1；在完整细胞中的活性为50 μmol · L-1。SL0101选择性抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，且对正常乳腺细胞无影响[55]。可能是由于细胞膜对SL0101的通透性较低，其体内药代动力学性质不佳[56]。

3.2 BI-D1870

BI-D1870是一种合成的小分子抑制剂，对RSK具有高度特异性[57]，与ATP竞争NTKD从而发挥RSK抑制作用。在体外测试中，BI-D1870对RSK亚型的抑制活性比对其他10种相关的激酶（如MST2、GSK-3β、LKB1等）的抑制活性强500倍以上；但与SL0101类似，BI-D1870对RSK的4种亚型并没有选择性[58]。在体外酶活实验中，BI-D1870的抑制活性与ATP浓度相关，当ATP浓度为10 μmol · L-1时，BI-D1870对RSK1 ～ 4的IC50为10 ～ 30 nmol · L-1。与体外酶活实验相比，在细胞水平抑制蛋白激酶的活性需要更高的化合物浓度，这与许多其他的蛋白激酶ATP竞争性抑制剂类似，其原因可能有以下3点：1）与体外酶活实验相比，细胞中ATP的浓度更高；2）BI-D1870可能存在细胞通透性障碍；3）RSK可能是一种相对活跃和丰富的蛋白激酶，部分抑制其活性可能不足以抑制底物的磷酸化[59]。

3.3 FMK

与其他抑制剂的作用方式不同，FMK靶向RSK的CTKD并产生不可逆的共价抑制作用[60]。FMK是一种针对RSK1/2的特异性抑制剂，通过与ATP结合区域内的Cys436共价结合而发挥强大的抑制作用。在体外实验中，FMK对RSK2激酶的IC50为15 nmol · L-1。RSK的CTKD负责自磷酸化作用，NTKD发挥底物的磷酸化作用。针对CTKD的抑制剂容易出现脱靶效应[61]，原因可能是RSK可以跳过自磷酸化作用直接激活NTKD，磷酸化下游底物。因此，FMK的应用存在一定局限性。

3.4 BIX 02565

BIX 02565是一种用于治疗心脑血管疾病的RSK2抑制剂[62]，在体外激酶测试中，其对RSK2激酶的IC50为1.1 nmol · L-1；在基于细胞的分析中，BIX 02565对RSK的IC50约 为20 nmol · L-1。在 对20种蛋白激酶的研究中发现，BIX 02565可抑制除RSK2之外的其他8种激酶[如富亮氨酸重复激酶2 （LRRK2）和蛋白激酶D1（PRKD1）]活性，但抑制活性低于对RSK2的活性[54]。

3.5 LJH 685和LJI 308

LJH 685和LJI 308是针对NTKD的ATP竞争性抑制剂，具有很高的选择性和良好的活性[63]，体外实验中对RSK2的IC50为4 ～ 13 nmol · L-1，在细胞中IC50为0.2 ～ 0.3 mmol · L-1。在10 mmol · L-1浓度下，LJH685和LJI308几乎100%结合RSK2，对其他3种亚型的抑制效力几乎相当，但对其他的激酶如RPS6、MEK的抑制强度远低于RSK。研究发现，LJI 308能通过消除肿瘤干细胞克服耐药[64]。晶体结构分析发现，LJH 685以一种非平面构象结合到NTKD上，其中3个芳香环呈螺旋桨状排列。LJI 308与LJH 685具有相似的结构和性质。非平面形状以及不同于常见抑制剂的构象特性可能是LJH 685和LJI 308选择性较高的原因[65]。

3.6 LY2780301

LY2780301是一个靶向AKT/RSK的双靶点抑制剂。一项评价LY2780301与紫杉醇联用疗效的临床试验结果表明，两药联用对HER2-乳腺癌和晚期TNBC患者有一定疗效[66]。并且，一项评价LY2780301与吉西他滨联用疗效的临床试验结果也证明联用方案对乳腺癌、宫颈癌等晚期转移性实体瘤有效[67]。

3.7 PMD-026

PMD-026是一类靶向RSK的口服小分子抑制剂，目前正处于Ⅰ期临床试验。PMD-026对RSK的4种亚型均有抑制作用，已公布的Ⅰ期临床试验结果表明，PMD-026具有良好的药效与药代动力学特性以及良好的安全性[68]。临床前研究表明，PMD-026在体外诱导乳腺癌细胞凋亡，在体内能有效抑制肿瘤生长，是一种有开发潜力的候选药物[69]。PMD-026能明显降低TNBC细胞p-YB-1的表达，YB-1是一种与癌细胞的存活、增殖、侵袭、转移相关的转录因子，主要由RSK磷酸化并激活，并且p-YB-1在TNBC的表达水平高于普通的乳腺癌类型。对p-YB-1的有效抑制为PMD-026的抗肿瘤疗效提供了有力的证据。

3.8 SCO-101

SCO-101是一个靶向RSK/ABCG2的双靶点抑制剂。该化合物在20年前被作为治疗镰状细胞贫血的新药而开发，但最终因可导致剂量依赖性游离型胆红素增加而终止研究[70]。近来研究发现了SCO-101的新用途，临床前研究结果表明，SCO-101与多西他赛联合用药，对多西他赛耐药的TNBC细胞的增殖有明显抑制活性[71]。多西他赛用于TNBC的治疗，疗效较好但易产生耐药性。体外研究结果表明，SCO-101单用与多西他赛的效力相当，与多西他赛联用时可产生协同作用。目前有2项关于SCO-101的Ⅱ期临床试验，其中一项试验将评价SCO-101与结直肠癌标准疗法联用的疗效，正在招募晚期转移性结直肠癌患者；另一项将评价SCO-101与吉西他滨和白蛋白紫杉醇联用的疗效，正在招募胰腺癌患者。

3.9 TAS0612

TAS0612是一种靶向AKT/RSK的双靶点抑制剂，临床前研究表明，TAS0612通过抑制p-YB-1的转录和核易位，有效克服抗雌激素类药物的耐药性，且在体内外均能有效抑制包括TNBC在内的多种乳腺癌细胞的增殖[72]。目前关于TAS0612的Ⅰ期临床研究正在招募各类转移性实体瘤患者。

4 p90核糖体S6激酶抑制剂的安全性

不良反应也是RSK2抑制剂研发过程中不可忽视的问题。RSK2抑制剂PMD-026用于TNBC患者的最新临床试验结果显示，使用RSK2抑制剂后患者总体状况良好，但不可避免地出现了Ras-Raf-MEK-ERK信号通路相关的抑制剂普遍存在的不良反应，最常见的是疲劳和呕吐；其次包括皮疹、眼部疾病、转氨酶升高等[73]。这些不良反应与之前报道的LY2780301安全性研究结果一致[74]，不同的是，由于LY2780301是AKT/RSK的双靶点抑制剂，其广泛的抑制作用导致了更为严重的不良反应，包括贫血、血小板减少和中性粒细胞贫血。

5 结语与展望

目前临床上针对TNBC的治疗方案大多是采用传统的化疗或放疗，不仅疗效不佳且毒副作用大。近年来靶向药物的快速发展和应用实践证明，其对包括TNBC在内的许多恶性肿瘤疗效明显，具有巨大的开发前景。此前有靶向MEK的抑制剂用于TNBC的研究报道[75]，但由于广泛的抑制作用和反向激活AKT信号通路，导致其疗效较弱而副作用较大。研究表明，ERK信号通路下游的RSK2在TNBC的发生、发展及转移中起到重要作用，且不反向激活AKT信号通路[76]，可以相信，RSK2将成为治疗TNBC具有潜力的靶标。