线粒体单基因突变罕见病的基因治疗研究进展

刘娜辉，王译，邢磊，姜虎林

（中国药科大学药学院，江苏 南京 210009）

1 引言

罕见病是指人群中发病率极低的疾病，一般为慢性、严重性疾病，通常会导致终身残疾或危及生命[1]。尽管罕见病的发病率低，但是由于人口基数较大，全球约有3.5亿人罹患罕见病，约占全球总人口的10%[2]。目前，全球约有7 000多种罕见病，其中80%属于遗传性疾病[3]。其中，由单一遗传缺陷引起的罕见病被称为单基因罕见病[4]，可分为核基因突变的单基因罕见病和线粒体基因突变的单基因罕见病[5]。线粒体是真核细胞中必不可少的细胞器，也是重要的遗传信息载体。线粒体拥有可独立遗传的环状基因组，称为线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），其具有母系遗传、基因结构紧密、拷贝数高、突变率高和异质性等特点[6]。在哺乳动物细胞中，mtDNA由于缺乏组蛋白保护、与线粒体内膜距离较近以及缺少DNA损伤修复系统等原因导致其容易发生基因突变[7]。而当细胞中突变型mtDNA达到一定数量时会引起细胞功能障碍，从而出现线粒体单基因突变罕见病的临床表现[8-10]。较为典型的线粒体单基因突变罕见病包括Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）[11]、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作（mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS）综合征[12]、肌阵挛性癫痫伴不规则红纤维（myoclonic epilepsy with ragged-red fibers，MERRF）综合征[13]、Kearns-Sayre综 合 征（Kearns-Sayre syndrome，KSS）[14]、慢性进行性眼外肌麻痹（chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO）[15]等。目前，小分子药物是线粒体单基因突变罕见病的临床一线用药，但是该类药物仅能缓解疾病的症状，而不能从根本上纠正突变的mtDNA，因此无法彻底治愈此类疾病[16]。

基因治疗是指通过分子生物学方法，将正常或有治疗作用的基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因的缺陷，从而实现治疗或者改善某种疾病的目的[17]。因此，传统的基因治疗或基因编辑手段有望通过补充正常的mtDNA或直接修复突变的mtDNA，达到治疗线粒体单基因突变罕见病的目的。此外，相比于小分子药物治疗而言，基因治疗具有特异性强、毒性低和作用时间长等优点，可显著减少给药次数并提高患者的顺应性[18]。目前，已有1款治疗单基因罕见眼病——Leber先天性黑朦（Leber congenital amaurosis，LCA）的基因治疗药物上市[19]。可以相信，基因治疗在线粒体单基因突变罕见病治疗领域具有巨大的发展潜力[20]。

线粒体单基因突变罕见病的基因治疗方法包括异位表达和原位线粒体基因疗法。由于线粒体递送屏障的存在，研究人员通过异位表达实现线粒体疾病治疗，该方法首先将含有线粒体靶向序列（mitochondrial-targeting sequence，MTS）的 治 疗DNA递送导入细胞核，随后转录得到的mRNA在MTS引导下靠近线粒体并将功能蛋白导入线粒体基质从而发挥作用。异位表达最常用的载体是病毒载体，包括慢病毒和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）。慢病毒因其能够实现外源基因的长期表达而被广泛运用于基因治疗领域，但其整合后存在诱变的风险[21]；AAV通过表现出染色体外结构稳定性来降低诱变风险，从而能够以较低的致癌风险进行长期表达，然而其安全性风险仍存在较大的争议[22]。异位表达虽然可以绕过线粒体屏障，但是这种两步递送的方法可能会影响整体基因治疗的效率。为了简化递送程序，研究人员开发了原位线粒体基因疗法，通过病毒或非病毒载体介导的方式将外源基因直接递送至线粒体。然而如何有效地跨越线粒体屏障将外源基因递送至线粒体基质仍然是原位线粒体基因治疗领域的一个巨大挑战。随着线粒体分子生物学的不断发展，越来越多基因递送系统相继出现，为线粒体单基因突变罕见病的基因治疗提供了希望。

本综述以2个具有代表性的线粒体单基因突变罕见病为例，归纳了其病理特征、基因递送屏障和临床试验中使用的治疗方法，并总结了针对该类疾病已开发的基因递送系统。最后，对基因疗法治疗线粒体单基因突变罕见病所面临的挑战和应用前景进行了系统的讨论。

2 全身性疾病——MELAS与MERRF综合征 的基因治疗

2.1 MELAS和MERRF综合征的病理学特征和线粒体屏障

MELAS综合征是一种涉及多个器官的疾病，常伴有身材矮小、反复头痛、癫痫、卒中样发作、听力障碍等临床特征[23]。83.7% MELAS综合征患者的致病突变为m.3243A＞G突变（即mtDNA 3243位腺嘌呤脱氧核苷酸突变为鸟嘌呤脱氧核苷酸）[24]。MERRF综合征的发生与4个突变位点有关，其中最常见的是m.8344A＞G突变[25]。这些由mtDNA的致病性突变而引发的疾病主要通过母系遗传，并已被确定为多系统线粒体疾病。

在MELAS和MERRF综合征患者的全身细胞中都发现了突变的线粒体。线粒体膜由多孔的线粒体外膜（outer mitochondrial membrane，OMM）和密集的、疏水的线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）组成，其双层膜结构的存在阻碍了治疗基因或药物的线粒体靶向递送[26]。同时，线粒体膜具有较高的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），在体外测量为－200 ～－180 mV，在活细胞中为－150 ～－130 mV[27]。复杂的线粒体屏障严格限制了外源离子和分子进入膜间隙，也限制了mtDNA突变相关单基因罕见病（如MELAS和MERRF综合征）治疗方法的发展。

2.2 现有治疗手段

目前该疾病并没有有效的治疗方法。临床可用的治疗手段主要集中在缓解相关症状或恢复线粒体呼吸链功能方面。例如，l-精氨酸和瓜氨酸疗法有利于预防由MELAS综合征引起的卒中样发作[28]。一些研究发现，辅酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）可应用于缓解MELAS综合征患者的肌肉无力和疲劳[29]。左乙拉西坦、托吡酯、唑尼沙胺、吡拉西坦和苯二氮䓬类药物均为抗癫痫药物，常用于治疗由MERRF综合征引起的肌阵挛和癫痫[30]。这些对症治疗可以缓解上述症状，但对疾病引起的其他并发症没有作用，因此找到一种能从根本上解决基因突变的方法尤为重要。

2.3 MELAS和MERRF综合征的基因治疗策略

2.3.1 病毒载体介导的基因治疗基因治疗发展迅速，但大多数此类研究都集中在具有大量患者的常见疾病上面，而MERRF和MELAS综合征等罕见疾病受到的关注相对较少。

尽管很少有研究团队开发针对MERRF和MELAS综合征的基因治疗策略，但用于纠正致病性mtDNA突变的线粒体基因编辑可以为治疗MERRF和MELAS综合征提供一种可行的方案。CRSPR/Cas9系统有利于解决核DNA突变，但由于其相对分子质量较大，难以进入线粒体基质直接纠正mtDNA突变。相反，传统的基因编辑方法似乎更适用于线粒体基因编辑。一些研究者使用AAV分别将线粒体靶向的锌指核酸酶（mitochondrially targeted zinc-finger nuclease，mtZFN）[31]或线粒体靶向转录激活因子样效应核酸酶（mitochondrialtargeted transcription activator-like effector nuclease，mitoTALEN）[32]递送至线粒体，并在小鼠模型中实现了疾病相关表型的逆转。Mok等[33]发现了一种名为DddA的细菌间毒素，它可以催化dsDNA中胞苷发生脱氨基作用。该课题组融合了DddA的不同部分、转录激活因子样效应阵列蛋白和尿嘧啶糖基化酶抑制剂，生成不含RNA的DddA衍生胞嘧啶碱基编辑器（DddA-derived cytosine base editor，DdCBE），在人类mtDNA中该编辑器可以准确高效地将CG转化为TA。DdCBE的出现使精确操纵mtDNA成为可能，在治疗线粒体单基因突变罕见病方面具有广阔的前景。

2.3.2 克服MELAS和MERRF综合征基因治疗的线粒体屏障在缺乏针对MELAS和MERRF综合征的线粒体基因治疗研究的情况下，可以参考现有线粒体基因递送的相关策略[34]。一些研究使用物理方法将遗传物质直接输送到线粒体，但该方法会对靶细胞造成较大的伤害。此外有研究者使用化学或生物学方法通过IMM的高疏水性和MMP的负电性实现线粒体靶向的基因递送[35]。常用的线粒体靶向基团包括非局部净正电荷基团，例如小分子化合物三苯基膦（triphenylphosphine，TPP）、地喹啉（dequalinium，DQA）和线粒体穿透肽（包括MTS肽和Szeto-Schiller肽）[36]。TPP具有正电性和疏水性，常用于靶向线粒体，笔者所在课题组利用TPP构建了一种线粒体靶向共聚物，实现了siRNA和药物的有效共递送[37]。

另外，许多研究者正在开发用于线粒体单基因疾病的非病毒载体材料。Yamada等[38]设计了一种名为MITO-Porter的复合物，可以通过膜融合将具有治疗作用的基因递送到线粒体。该课题组筛选多种脂质成分并通过八精氨酸表面修饰制备得到精准靶向线粒体的MITO-Porter体系。随后，该课题组设计了一种名为pCMV-mtLuc的递送体系，其中含有CMV启动子和荧光素酶（NanoLuc，Nluc）。在这项工作中，他们利用KALA肽代替了先前使用的八精氨酸以制备KALA-MITO-Porter。在KALA和膜融合的共同作用下，KALA-MITOPorter在线粒体单基因疾病患者的G625A成纤维细胞中表现出较好的线粒体靶向能力（见图1）[39]。Yamada等开发的基于非病毒载体的线粒体基因疗法有望治疗各种线粒体单基因疾病，包括MELAS和MERRF综合征。

图1 MITO-Porter体系向线粒体递送基因的示意图[39]Figure 1 Schematic diagram of MITO-Porter system delivering genes to mitochondria

3 眼病LHON的基因治疗

3.1 LHON 的病理学和眼屏障

LHON是由mtDNA突变引起的失明[40]，其中超过95%的突变是由于线粒体呼吸链复合物上3个亚基中的1个突变所引起的。在我国，90%的LHON患者为m.11778G＞A突变，导致线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4（NADH dehydrogenase 4，ND4）发生组氨酸取代精氨酸[41]，进而引起线粒体功能障碍。线粒体功能障碍可引起细胞内ATP合成量减少，氧化磷酸化缺陷，同时可产生过量活性氧（reactive oxygen species，ROS），进一步损伤线粒体及细胞内的核酸、蛋白和脂类。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）只在椎板处有髓鞘覆盖，其他部位均处于裸露状态，动作电位的产生与传播都需要消耗更多的能量。因此，相对于身体内其他类细胞，RGC更容易受到线粒体功能障碍的影响，导致RGC的功能异常，从而使细胞凋亡，最终引起视觉丧失[42]。

RGC线粒体活性的恢复是LHON治疗的关键问题。由于RGC位于视网膜的表面，所以其主要的眼屏障是玻璃体屏障[43]。玻璃体分为2个区域：髓质玻璃体和皮质玻璃体。髓质玻璃体是胶原蛋白和透明质酸的无细胞混合物，以凝胶或液体状态存在[44]。皮质玻璃体包围着髓质玻璃体。虽然皮质玻璃体只占玻璃体总体积的2%，但它含有对玻璃体代谢至关重要的体细胞。此外，纤维细胞是相关结缔组织的重要组成部分，也位于皮质玻璃体中。体细胞和纤维细胞的存在，使皮质玻璃体以更稠密的纤维状形态存在。因此，在LHON中实现生物大分子递送的先决条件是治疗药物在玻璃体注射后必须保持可移动性才能到达视网膜层的靶细胞。

3.2 现有治疗手段

艾地苯醌（idebenone，Ide）是目前唯一被批准用于治疗LHON的药物。作为抗氧化剂，Ide可以绕过线粒体呼吸链复合物Ⅰ直接将电子转移到线粒体呼吸链复合物Ⅲ，恢复ROS平衡并使细胞ATP生成正常化[45]。然而，该药只能缓解LHON的症状，

并不能从根本上解决LHON基因突变所带来的问题。基因治疗是治愈LHON最可行的方法[46]。Luxturna是一种由罗氏公司（Roche）开发的病毒载体基因疗法，用于治疗因RPE65基因突变导致的失明，如LCA。这是首个上市的用于治疗LCA的基因治疗药物，也是首个被批准用于治疗单基因罕见眼部疾病的基因疗法，鉴于Luxturna的成功上市[47]，LHON也很可能通过眼部基因疗法得到治愈。

3.3 LHON的基因治疗策略

3.3.1 病毒载体介导的基因治疗随着对LHON生物分子机制研究的不断深入，一些研究人员利用异位表达来恢复线粒体基质中受损蛋白质的功能，他们将含有MTS的治疗质粒DNA导入细胞核，随后转录得到的mRNA在MTS引导下靠近线粒体并将功能蛋白导入线粒体基质从而发挥作用[48-49]。这些基因治疗方案目前正处于临床试验的不同阶段。其中大多数通过AAV介导的核基因递送手段将一种线粒体靶向序列修饰的质粒递送到细胞核，最终将翻译得到的治疗性蛋白质转运至线粒体中（见表1）。

表1 临床在研的Leber遗传性视神经病变基因疗法Table 1 The gene therapies for Leber’s hereditary optic neuropathy in clinical development

另外一种策略是病毒载体介导的原位线粒体基因疗法。与MELAS和MERRF综合征的基因治疗类似，在线粒体基质成功表达mtDNA的2个先决条件是：设计mtDNA递送系统和开发有效的基因载体。Yu等[50]将AAV衣壳蛋白和MTS肽融合作为载体，用于递送mtND4基因。研究人员在细胞和动物水平上验证了该载体的基因递送效率。总的来说，这些研究为原位线粒体基因递送技术的发展提出了新的方向。

3.3.2 非病毒载体介导的基因治疗在原位线粒体基因治疗中构建合适的裸mtDNA质粒是至关重要的。为实现mtDNA的递送，Yasuzaki等[51]设计了pHSP-mtLuc（CGG）作为高效裸质粒DNA。pHSPmtLuc（CGG）是由线粒体重链启动子（heavy strand promoter，HSP）和mtDNA序列构成的线粒体报告质粒DNA，该mtDNA序列是编码适应线粒体密码子的NanoLuc（Nluc）荧光素酶报告基因，并且作者验证了该裸质粒DNA对mtDNA递送的效率（见图2）。

图2 含有线粒体重链启动子的裸DNA质粒在基因治疗中的应用[51]Figure 2 Application of naked DNA plasmid containing mitochondrial heavy chain promoter in gene therapy

“2.3.2”节中介绍的MITO-Porter系统也可应用于LHON治疗。此外，由于氨基酸在体内容易降解，具有生物相容性的多肽可作为基因载体材料。Chuah等[52]通过用酵母细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ的12个残基区域序列修饰KH序列生成Cytcox-KH，并将鸟氨酸转氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）的32个残基与KH序列融合生成OTC-KH（见图3）。Cytcox-KH在人胚胎肾（human embryonic kidney，HEK）293细胞中表现出良好的线粒体转染能力。笔者所在课题组成功构建了一种病理响应性线粒体基因递送载体TISUH，其可以通过TPP和氟化作用克服LHON中降低的MMP，较好地实现对病变线粒体的靶向作用；同时该递送载体可以在线粒体高ROS条件下发生降解，释放功能基因，从而提高基因转染效率，从根本上纠正mtDNA突变带来的异常[53]（见图4）。

图3 具有良好生物相容性的双结构域多肽在靶向线粒体的基因递送中的应用[52]Figure 3 Application of dual-domain peptides with good biocompatibility in gene delivery targeting mitochondria

图4 TISUH在LHON的原位线粒体基因治疗中的应用[53]Figure 4 Application of TISUH in in-situ mitochondrial gene therapy for LHON

为了实现LHON的原位线粒体基因疗法，基因治疗体系需要在玻璃体注射后克服玻璃体屏障到达RGC才能发挥作用。Martens等[54-55]报道了一种用于检测荧光纳米粒在完整玻璃体中移动速度的离体实验。他们使用不同相对分子质量的透明质酸修饰阳离子聚合物/DNA纳米粒，发现具有较低相对分子质量（22 000和137 000）的透明质酸可以增加复合物在玻璃体中的流动性。

目前关于原位mtDNA递送的研究较少，在多数情况下，线粒体基因递送效率难以在体内得到验证。因此，开发用于LHON治疗的原位线粒体基因疗法依旧任重道远。

4 结语与展望

近年来，基因治疗已经在癌症和部分遗传性疾病治疗领域取得了重大突破，针对线粒体单基因突变罕见病开展的临床和临床前研究也取得了积极的进展。然而，线粒体单基因突变罕见病的基因治疗仍面临着许多挑战。无论是异位表达还是原位线粒体基因治疗均需要安全有效的基因递送载体。病毒载体因其转染效率高而在临床研究中得到了较广泛的应用，但其仍存在潜在的安全问题和免疫原性风险；非病毒载体具有成本低、安全性高、可修饰等优点，但有限的基因转染效率限制了其在该领域的进一步应用。此外，缺乏相应的动物模型和足够的临床样本导致临床转化试验的开展具有较大难度。

虽然基因治疗存在许多挑战，但它仍然是解决线粒体单基因突变罕见病难题的有效途径。为安全有效的药物递送过程开发更合适的递送载体、提高其工业化生产的可行性，并建立符合疾病临床特征的动物模型是未来发展的主要方向。目前，线粒体单基因突变罕见病的基因治疗效果及临床前研究的众多进展表明，基因疗法在治疗线粒体单基因突变罕见病方面具有巨大的潜力和发展前景。