miR-21促进肺癌进展相关机制及潜在治疗靶点

肖洪秋，亓伟峰，郝 鹏，李 曈，高 存，司立博，孙振国，田 辉

（山东大学齐鲁医学院齐鲁医院胸外科，山东 济南 250012）

肺癌是严重威胁人类健康的疾病之一，目前其发病率和死亡率已经跃居所有癌症之首[1]。随着精准医学的不断发展，近年来肺癌的诊断与治疗手段不断完善，但其生长迅速、易转移复发及快速耐药的特点使得患者的总体预后仍较差，5 年生存率只有15%[2]。MiRNAs (microRNA) 是一类内源性的长约19 ～24 个核苷酸的短链非编码RNA，可通过多种方式参与基因表达的调控，进而参与细胞增殖、凋亡、迁移等过程，在肿瘤的发生与发展中发挥着重要的作用[3]。肺癌组织中的MiRNA 具有稳定的表达谱，其检测方法也较mRNA 更加简便，因此其作为新一代肿瘤分子生物标志物和靶向治疗位点已成为近年来广泛研究的热点之一[4]。miR-21 是由位于17p23. 2 染色体区域的MIR21 转录的内源性非编码RNA[5]。成熟的miR-21 约由22 个核苷酸分子组成，其可通过与各种靶基因mRNA 的3′非翻译区形成不完全碱基配对参与RNA 诱导的沉默复合体的形成，导致特定的mRNA的翻译减少，下调靶基因的表达[3,5]。研究发现，miR-21作为一种致癌的miRNA（oncomiR），在多种实体瘤中的表达显著增加，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾细胞癌等[6-8]。miR-21 在非小细胞肺癌（NSCLC）中可以通过改变各种靶分子（如3- 磷酸激酶、程序性蛋白死亡受体等）的表达来调节癌细胞的生长、转移、凋亡，降低遗传稳定性[9]。作为在肺癌中表达量最高的miRNAs 之一，尽管其潜在调节机制在很大程度上尚不清楚，但大量研究已经证实其表达水平在预测NSCLC 的诊断和预后方面具有重要的意义。本文现就miR-21 在NSCLC 发生发展中作用的研究进展进行综述。

1 miR-21 促进肺癌的作用及机制

miR-21 可通过影响细胞周期蛋白质D1 和E1 的合成和活化来调控肺癌细胞增殖和细胞周期进程[10]，此外它还可以作用于PTEN，降低癌症抑制因子PTEN的蛋白表达水平，通过PTEN/Caspase 3 抑制肺癌细胞的凋亡[11]。有研究指出，与普通PC-9 细胞相比，吉非替尼耐药的PC-9 细胞中miR-21 的表达明显上调，而PTEN 明显下调。临床试验证实，高miR-21、低PTEN表达水平往往预示着NSCLC 患者对于酪氨酸激酶抑制剂的临床反应较差，总体生存率较低[12]。在对细胞侵袭的作用方面，miR-21 可以抑制RECK 的表达，从而提高MMP-2/MMP-9 的水平，促进细胞侵袭[13]；还可以通过PTEN/Akt/GSK3β 级联信号通路来调节E-cadherin、 vimentin、 snail、slug 、β-catenin 等侵袭标记物的表达，促进癌细胞的侵袭及间充质转化[14]。

有研究指出，miR-21 可直接作用于Tropomyosin 1(TPM1) 基因，调节其转录，miR-21 的过度表达会降低TPM1 的蛋白水平，介导细胞迁移和侵袭[15]。在程序性细胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR 中也存在潜在的miR-21 靶基因结合位点，miR-21 可降低人和小鼠细胞中Pdcd4 蛋白的水平。研究表明，通过上调PDCD4 的表达抑制miR-21 的表达可减少A549 NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。miR-21 还会参与EGFR 介导的信号通路，激活EGFR 信号通路可上调miR-21 的表达，增强细胞耐药[17]。

2 miR-21 在NSCLC 诊断中的应用

Yanaihara 等[18]率先利用基因芯片发现miR-21在肺癌组织中呈现高表达。后续的研究中，Tian等[19]通过qPCR 测定了204 对福尔马林固定石蜡包埋NSCLC 组织样本及其相应的邻近正常组织中miRNA-21 的表达水平，发现与邻近正常组织相比，NSCLC 组织中miR-21 的表达显著增加。后来的多项研究均证实，相对于癌旁正常肺部组织，NSCLC 组织中miR-21 的表达异常增高，其表达水平与患者TNM分期以及转移及预后情况相关[20-21]。

由于采血操作侵入性小，血液样本的获取较为容易，血清中不同miRNA 的表达水平与各种肿瘤预后之间的关系已成为许多研究的焦点。最近的研究表明，它们是预测各类癌症发生和预后的有效生物标志物。有研究表明，肺癌患者血清中的miR-21 显著高于健康人的水平，检测血清中的miR-21 可作为肺癌早期非侵入性筛查的新策略[19,22]。Geng 等[23]发现，NSCLC 患者五种miRNA（miR-20a、miR-223、miR-21、miR-221和miR-145）的表达水平相对于健康志愿者明显失调，随后他们在126 例早期肺癌患者、42 例非肿瘤性肺部疾病患者和60 名健康志愿者的血浆样本中检测了这5 种miRNA 的表达情况，并分析了这种组合在NSCLC 早期诊断中的应用价值。结果显示，单独使用这5 种miRNA 诊 断 早 期NSCLC 的AUC 分 别 为0.89、0.94、0.77、0.92 和0.77。进一步的分析表明，血浆miR-20a、miR-223、miR-21 和miR-145 在吸烟者中比在非吸烟者中显示出更好的诊断价值，而miR-155 可能更适合于非吸烟者人群。此外，它们在晚期患者和鳞癌亚组中的准确性会更高，能够将NSCLC 与非肿瘤性疾病以及健康人区分开来。Zhao 等[24]从60名健康人中收集血清作为对照，使用实时荧光定量PCR 检测80 例NSCLC 患者血清中miR-21 的相对表达水平，绘制受试者操作曲线分析血清中miR-21 最合适的临界值和诊断值。结果证实，NSCLC 患者血清miR-21 的水平明显高于健康人（P＜0.05）。在临界值设为1.22 的情况下，ROC 曲线下的面积为0.812（95% 可信区间：0.736，0.888），敏感度为73.8%，特异度为71.7%。根据该临界值区分NSCLC 患者为高表达组还是低表达组，进行Kaplan-Meier 分析表明，高miR-21 表达组的生存时间为23.1 个月，低miR-21 表达组的生存时间为34.3 个月，高miR-21表达组的生存时间显著短于低miR-21 表达组。有研究表明，联合检测miR-21 和其他相关分子可以提高NSCLC 早期诊断的准确性和特异性。Tang 等[25]从62 名NSCLC 患者和60 名健康的吸烟者的血清中分离并鉴定出了3 种异常表达的miRNA（miR-21、miR-145和miR-155），随后在34 名恶性肿瘤患者、30 名良性肺结节患者和32 名健康吸烟者中测试并验证这3种miRNA 的表达水平及联合诊断效率，发现联合检测miR-21、miR-145 和miR-155 的表达水平不仅可以区分肺癌患者和健康吸烟者（AUC：0.872，敏感度：76.5%，特异度：81.3%），对于肺癌患者与良性肺结节患者也有较好的分辨能力（AUC ：0.841，敏感度：76.5%，特异度：80.0%）。总之，这些研究表明，miR-21和其他分子的不同组合在NSCLC 中存在潜在诊断价值，血浆miR-21 的水平可能是NSCLC 患者早期诊断的重要补充。

痰液和肺泡灌洗液中miR-21 的表达水平也是NSCLC 的重要诊断依据。Kim 等[26]通过联合检测痰液中的5 种miRNA（miR-21、miR-143、miR-155、miR-210 和miR-372）发现，诊断早期NSCLC的敏感度和特异度分别高达67.8% 和90%。同时，这种miRNA 组合在肺泡灌洗液组的敏感度和特异度分别 高 达86.7% 和100%。Razzak 等[27]从21 例 早 期NSCLC 患者（Ⅰ期和Ⅱ期）、22 例晚期NSCLC 患者（Ⅲ期及以上）和10 例健康对照者中收集痰样本，进一 步 分 析miR-21、miR-210 和miR-372 在NSCLC早期诊断中的潜在应用价值。结果发现，联合使用这3 种miRNA 诊断早期NSCLC 的敏感度和特异度分别高达67% 和90%，对晚期NSCLC 的敏感度和特异度分别高达64% 和100%。因此，优化痰样本中特异性miRNA 的组合，以实现早期诊断NSCLC 将是未来研究的一个重点。

3 miR-21 的表达水平可以预测NSCLC 的预后情况

除了协助肺癌的诊断以外，miR-21 的表达情况还可以提示NSCLC 的预后情况。上文提到的Tian等[19]的研究不仅发现NSCLC 组织中miR-21 的表达显著增加，还进一步分析了miR-21 在晚期NSCLC（Ⅱb ～Ⅲa 期）组织中的表达远高于早期NSCLC（Ⅰa ～Ⅱa 期）组织中的表达。有研究指出，miR-21高表达的患者也有较高的淋巴结转移率，但是miR-21表达水平与肿瘤大小之间没有相关性。Kaplan-Meier生存分析进一步证实，与miR-21 低表达的NSCLC患者相比，miR-21 高表达的NSCLC 患者的总生存时间（OS）和无进展生存时间（PFS）显著减少。因此，miR-21 表达增高或许是NSCLC 患者OS 降低的一个新的独立预后因素，癌组织内miRNA-21 的表达水平可以预测NSCLC 的预后。此外，miR-21 的表达也可能是伴有淋巴结转移的NSCLC 患者的潜在预后标志物。Stenvold 等[28]在NSCLC Ⅰ期至Ⅲa 期患者中收集了335 个肿瘤组织，并使用原位杂交法测定了肿瘤细胞和肿瘤间质细胞中的miR-21 水平。出乎意料的是，研究结果表明，肿瘤细胞中miR-21 表达量的增高是淋巴结转移患者的积极预后指标，而基底细胞中miR-21 的高表达是他们的不良预后指标。这项研究的结果与其他研究的结果不一致，因此，需要进一步的研究来阐明这种差异的原因。

鉴于在NSCLC 患者的预后中，血清miR-21 水平与癌组织中miR-21 水平的影响一致[29]，结合血清miR-21 的表达水平进行相关评估极有可能成为预测NSCLC 预后的一个重要方向。Wang 等[22]的研究发现，血清miR-21 高表达的NSCLC 患者的3 年生存率明显低于血清miR-21 低表达的NSCLC 患者，且NSCLC 患者血清miR-21 水平的升高与TNM 分期和淋巴结转移呈正相关。基于NSCLC 患者OS 的多元逻辑回归分析显示，血清miR-21 水平是该疾病的独立预后因素（HR ：2.01）。

近年来，越来越多的证据表明，癌细胞分泌的外泌体在各种肿瘤的诊断和预后判断中具有潜在应用价值[30]。外泌体是一种细胞外囊泡，直径为30 ～100nm，广泛存在于体液中，其内部可携带多种生物分子，包括蛋白质、RNA、DNA 和脂质等，对细胞通讯及细胞活动的调控起着重要作用[31]。Munagala等[32]最近的一项研究发现，外泌体中的miR-21 水平也可能是肺癌复发的标志。他们建立了原发性和复发性肺癌的裸鼠模型，并分别检测了肿瘤中和血清外泌体中miRNA 的变化情况。结果发现，与原发性肿瘤相比，复发性肿瘤中miR-21 和miR-155 两种miRNA的表达显著上调，这些miRNA 在复发性肿瘤动物的血清外泌体中的表达也明显增加。该研究表明，外泌体中的miRNA 信号可能提示肺癌的预后与复发，在作为肺癌的生物标志物方面有着巨大潜力。

4 miR-21 在临床治疗中的应用前景

基于miRNA 在基因表达调节以及与患者临床预后相关性的证据越来越确凿，上调或下调特定miRNA 的表达水平可能是治疗癌症的一个有希望的方法。一般情况下，靶向miRNA 的疗法有两种方法，一种是miRNA 替代疗法，对于在肿瘤中表达下调的miRNA，可以使用与miRNA 结构相似的mimics，模拟miRNA 的功能，恢复肿瘤抑制基因的功能；另一种是miRNA 拮抗剂，对于在肿瘤中表达上调的miRNA，利用反义技术合成的靶向性的反义寡核苷酸可以与它们结合形成互补的RNA，从而被RNA酶分解，可阻断其功能，增加该种miRNA 靶向的mRNA的翻译[33]。然而，到目前为止，这两种方法在临床上的应用都非常有限，大多数相关研究都是在体外进行的。由于miR-21 在肺癌中的表达上调，应用miR-21反义寡核苷酸治疗肺癌已成为该病治疗的新希望[34-35]。

5 总结

miRNA 在肺癌的发生发展中发挥着重要的调节作用，miR-21 已经被证实可通过多种方式参与肺癌和其他恶性肿瘤的发生。miR-21 相关的诊断与预后信息对于临床决策有着重要的作用，靶向miR-21 的治疗可能会成为肺癌治疗的新方向。笔者认为，随着未来对miRNA 研究的深入，miRNA 将会越来越多地应用于相关疾病的诊治中。