裘氏宁更培元汤对围绝经期综合征大鼠雌激素受体及其关键酶表达的影响*

莫达瑜 赵阳春 应 翩 沈 雁 赵 蕾#

1 浙江中医药大学附属第二医院 浙江 杭州 310005 2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

围绝经期综合征（PMS）是指绝经期前后妇女伴随着卵巢功能逐渐衰退、雌激素水平下降而出现的以内分泌失调和植物神经功能紊乱为主，伴有神经、心理症状的一组症候群[1]。中医各医家治疗PMS虽用药不同，但总体治疗准则是从肝肾论治[2]。宁更培元汤为浙派裘氏妇科嫡系传人张萍青教授的验方，针对PMS肝肾阴虚的重要病机，以“益气养血、滋补肝肾”为法，能明显缓解PMS典型症状。笔者以围绝经期大鼠为研究对象，观察裘氏宁更培元汤对PMS模型的子宫卵巢指数、血清性激素水平、卵巢组织雌激素受体及其关键酶表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物：健康雌性SPF级Wistar大鼠50只，13月龄、体质量220～260g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物生产许可证号：SYXK（浙）2018-0012。大鼠于干燥、通风、安静、室温（24±2）℃、湿度50%～60%的实验动物房中适应性饲养7d后用于实验。

1.2 药物：裘氏宁更培元汤组方：牡丹皮、地骨皮、黑大豆、瘪桃干、制首乌、制龟甲、山萸肉、珍珠母、夜交藤、淮小麦、大枣和山药共12味药材。上述饮片浸泡蒸馏水后常规煎煮、过滤、浓缩为3g/mL的灌胃液，-20℃冰箱保存备用。

1.3 试剂：PVDF膜（Millipore公司，批号：K5JA5013L）；彩色预染蛋白分子量标准（Fermentas公司，批号：00174777）；雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）定标液（德国罗氏公司，批号分别为：56672603、57173301和53179003）；ERα（cell signaling公司，批号：8644s）；17α-羟化酶（CYP17，Abcam公司，批号：ab125022）；17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD，SANTA公司，批号：SC-376719）；β-Actin（上海联科生物，批号：ab008-100）。

1.4 仪器：罗氏Cobas E602化学发光仪（德国罗氏公司）；SpectraMax Plus 384型全波长酶标仪（MD公司）；H1650R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器公司）；Mini-Proten Tetra System电泳系统（Bio-RAD公司）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪（Bio-RAD 公司）。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 造模、分组及处理：参照自然衰老法[3]建立围绝经期大鼠模型：选择动情周期紊乱、动情周期延长的40只初老Wistar大鼠，按体质量匀齐原则分为4组：PMS模型组、中药低、中和高剂量组。另选10只动情周期正常的Wistar大鼠作为正常对照组。按成人-大鼠体表面积换算，中药低、中、高剂量组大鼠分别以临床等效剂量的1/2、1和2倍（即0.168g/mL、0.336g/mL、0.672g/mL的生药2mL）灌胃；正常对照组和PMS模型组均以等体积蒸馏水灌胃；每日1次，连续28d。

1.5.2 标本采集：末次给药后24h，最后1次称重并记录后采血，收集静脉血约5mL。后迅速脱颈法处死大鼠，打开大鼠盆腔，分离子宫、卵巢周围脂肪组织，剖取子宫、卵巢。

1.5.3 评估大鼠子宫卵巢指数变化：剖取的子宫、卵巢在电子天平上称取湿重并记录，计算大鼠子宫、卵巢指数：①子宫指数=子宫湿重/大鼠体重×100%；②卵巢指数=双侧卵巢湿重/大鼠体重×100%。

1.5.4 化学发光法检测大鼠血清性激素水平变化：眶静脉血分离获取血清，根据试剂盒要求检测血清E2、FSH和LH的含量。

1.5.5 western blot法检测卵巢雌激素受体及其关键酶水平变化：提取卵巢组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。各组均取20μg蛋白，加等体积上样Buffer混合，100℃变性5min，以每孔20μL的上样体积加入12%的分离胶和4%的浓缩胶中进行SDS-PAGE电泳30min，转入PVDF，封闭1h；ERα、CYP17和17β-HSD一抗均以1∶1000稀释，4℃杂交过夜；二抗以1∶5000稀释，37℃反应2h，洗膜3次后，ECL化学发光法显影。图像处理软件分析条带灰度值，β-actin为内参校正上样量。

1.5.6 统计学方法：采用SPSS 20.0统计分析软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫卵巢指数比较：结果见表1。

表1 各组大鼠子宫卵巢指数比较（±s，n=8）

表1 各组大鼠子宫卵巢指数比较（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与PMS模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药中剂量组比较，**P＜0.01。

卵巢指数（100%）0.042±0.008 0.022±0.004##0.032±0.003△0.035±0.004△△0.037±0.007△△组别正常对照组PMS模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组子宫指数（100%）0.292±0.021 0.101±0.012##0.176±0.007△0.194±0.018△△0.226±0.015△△**

2.2 各组大鼠血清性激素水平比较：结果见表2。

表2 各组大鼠血清性激素水平比较（±s，n=8）

表2 各组大鼠血清性激素水平比较（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与PMS模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药中剂量组比较，*P＜0.05。

LH(IU/L)6.40±0.52 8.80±0.46##8.11±0.57 7.59±0.52△△6.90±0.39△△组别正常对照组PMS模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组E2(pmol/L)94.64±12.50 31.80±10.75##47.26± 8.67△62.38±11.14△△78.32±10.03△△*FSH(IU/L)4.36±0.61 6.11±0.57##5.48±0.29△5.11±0.27△△5.00±0.24△△

2.3 各组大鼠卵巢ERα及其关键酶CYP17、17β-HSD水平比较：与正常对照组比较，PMS模型组ERα、CYP17、17β-HSD的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与PMS模型组比较，上述三个蛋白在中药低剂量组的表达水平略有上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）；而中药中、高剂量组ERα、CYP17和17β-HSD的表达水平均较PMS模型组明显升高，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果见图1。

图1 各组卵巢ERα及其关键酶CYP17、17β-HSD水平比较

3 讨论

现代医学研究证实，下丘脑腺垂体分泌FSH和LH，通过二者协调作用刺激卵巢分泌成熟卵泡、产生E2，从而调节卵巢功能盛衰。在PMS的病理生理过程中，E2起到了极为重要的作用，它能够调节性腺、神经内分泌、骨骼、心血管和其他组织的功能[4]。但是，雌激素需要与其受体相结合才可激活下游激素受体，从而传递给下丘脑-垂体-卵巢轴。卵巢雌激素受体α（Estrogen Receptor，ERα）作为雌激素结合的靶点[5]，在体内的生物学特性上存在许多的差异，在调节下丘脑-垂体-卵巢轴中占据重要地位。CYP17和17β-HSD作为编码雌激素合成代谢关键酶的基因，已被多项研究证实与人体内的内源性雌激素水平有关联[6]。CYP17、17β-HSD等关键酶均参与卵巢颗粒细胞雌激素的合成、代谢和运输[7]。雌激素受体基因表达和这些酶的异常活性是导致PMS中围绝经期雌激素水平改变的主要因素。

本次实验结果表明宁更培元汤能有效提升PMS大鼠的雌激素合成代谢水平，进而改善PMS症状，从分子水平揭示了该方的部分疗效机制，为其进一步临床推广应用提供了客观依据。