SPE-LC-MS/MS和SPE-GC-MS/MS测定前胡禁用农药残留及结果分析*

周 琴 董 军 蒋永海 王伟倩 邓俊杰

1 绍兴市中医院 浙江 绍兴 312000

2 绍兴市食品药品检验研究院 浙江 绍兴 312071

前胡为伞形科植物白花前胡（Peucedanum praeruptorum Dunn）的干燥根。功能降气化痰，散风清热，用于痰热喘满，咯痰黄稠，风热咳嗽痰多[1]。为了解决中药材农药残留问题，2020版《中华人民共和国药典》2341农药残留测定法中新增了第五法，对中药药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留做了相关要求[1]。依据此标准，本研究采用高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）对浙江临安、浙江淳安、安徽安国、四川广元、贵州毕节5个产地前胡中的农药残留进行测定，并分析检测结果。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Agilent 8890B-7000D气相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪，Agilent1260-6470高效液相色谱串联质谱联用仪，超纯水仪（美国Millipore公司），百万分之一电子天平（梅特勒-托列多仪器上海有限公司），Auto EVA 80高通量全自动平行浓缩仪（睿科集团）、移液枪、容量瓶、涡旋混合仪、三号筛、离心机。

1.2 试药：药材来源：前胡样品分别来源于浙江临安、浙江淳安、安徽安国、四川广元和贵州毕节，经绍兴市食品药品检验研究院蒋永海主任中药师鉴定为伞形科植物白花前胡的根，标本存放于原药材标本室。试剂：甲酸（CNW V6300090）、甲酸铵（CNW Q7400014）、乙腈（RCI LABSCAN 18 03 0034）、超纯水：电阻率18.2MΩ.cm（美国Millipore公司）；禁用农药混合对照品溶液（安谱：D6850065）及相关化学品标准物质；HLB固相萃取柱；内标溶液：磷酸三苯酯（安谱：G172525）。

2 方法

2.1 GC-MS/MS色谱条件：具体如下。

2.1.1 GC色谱条件：用（50%苯基）-甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱Agilent VF-17MS（柱长为30m，柱内径为0.25mm，膜厚度为0.25µm）。进样口温度280℃，不分流进样。载气为高纯氦气（He）。进样口为恒压模式，柱前压力为146kPa。程序升温：初始温度80℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，再以每分钟2℃的速率升温至230℃，最后以每分钟25℃的速率升温至320℃，保持3min。

2.1.2 GC质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电子轰击源（EI），离子源温度250℃。碰撞气为高纯氦气。质谱传输接口温度320℃。质谱监测模式为多反应监测（MRM），各化合物监测离子对、碰撞电压（CE）等。见表1。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。

表1 GC-MS/MS测定农药的方法学考察结果

2.2 LC-MS/MS色谱条件：具体如下。

2.2.1 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Poroshell 120 EC-C18（柱长10cm，内径为 2.1mm，粒径为2.6µm）；以0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸铵）（95：5）为流动相B，按下表2进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL，柱温为40℃。

表2 流动相梯度

2.2.2 质谱条件：以三重四极杆串联质谱仪检测；离子源为电喷雾（ESI）离子源，正离子扫描模式。监测模式为多反应监测（MRM），各化合物参考监测离子对、碰撞电压（CE）见表3。为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各农药。

表3 LC-MS/MS测定农药的方法学考察结果

2.3 对照溶液的制备：具体如下。

2.3.1 混合对照品溶液的制备：精密量取禁用农药混合对照品溶液（已标示各相关农药品种的浓度）1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备：取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每毫升含l.0mg的溶液，再取1.0mL加乙腈→100.0mL，即得。

2.3.3 空白基质溶液的制备：取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

2.3.4 基质混合对照溶液的制备：分别精密量取空白基质溶液1.0mL（6份），置Auto EVA 80高通量全自动平行浓缩仪上，40℃水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液 10µL、20µL、50µL、100µL、150µL、200µL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。

2.4 供试品溶液的制备：具体如下。

2.4.1 提取：取供试品粉末（过三号筛）5g，精密称定，加氯化钠1g，立即摇散，再加入乙腈50mL，匀浆处理2min（转速不低于每分钟12000转），离心（每分钟4000转），分取上清液，沉淀再加乙腈50mL，匀浆处理1min，离心，合并两次提取的上清液，减压浓缩至3～5mL，放冷，用乙腈稀释至10.0mL，摇匀，即得。

2.4.2 净化：量取直接提取法制备的供试品溶液3～5mL，通过亲水亲油平衡材料（HLB SPE）固相萃取柱（200mg，6mL）净化，收集全部净化液，混匀，即得。

2.5 测定：①气相色谱-串联质谱法：分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1mL，精密加入内标溶液0.3mL，混匀，滤过，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1µL，注入气相色谱串联质谱仪，按内标标准曲线法计算，即得。②高效液相色谱-串联质谱法：分别精密吸取上述的基质混合对照溶液和供试品溶液各1mL，精密加入水0.3mL，混匀，滤过，取续滤液。分别精密吸取上述两种溶液各1µL，注入液相色谱-串联质谱仪，按外标标准曲线法计算，即得。

3 结果

3.1 方法学考察：具体如下。

3.1.1 标准曲线与检测限：取不同浓度的基质混合标准溶液（8～200ng/mL）进行测定，绘制标准曲线，结果表明，各农药及相关化学品在各自线性范围内与测定值线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99，取信噪比（S/N）约为3，计算检测限（LOD）,结果见表1及表3。

3.1.2 加样回收试验：取空白样品粉末5g，加入混合对照品溶液，按“2.3.4”项下方法制备供试品溶液并测定，结果低、中、高浓度（0.02、0.04、0.1mg/kg）的平均回收率在70.56%～138.99%，RSD在0.2%～6.3%，见表1及表3。

3.1.3 精密度试验：取20ng/mL基质混合标准溶液，连续进样6次，计算精密度，结果RSD在0.2%～9.2%，见表1及表3。

3.2 样品中残留农药测定：对5批前胡进行检测，计算农药残留量。结果5批样品中有检出部分农药测得值均在检测限附近，判定结果为均未检出禁用农药。

4 讨论

4.1 基质效应：基质指的是样品中除分析物以外的组分，由于基质效应的存在，基质常常对分析物的分析过程中产生显著干扰，影响分析结果的准确性，前胡提取液所得的化学成分复杂，试验发现绝大多数农药液相色谱质谱基质抑制效应明显，气相色谱质谱基质增强效应明显，前胡基质效应不可忽视。试验中，除了标准曲线采用前胡农药空白基质配制混合标准品溶液外，对提取液进行净化处理也有助于减少基质效应。农药残留检测的常用净化方式有直接提取法、QuEChERS法、SPE法、磺化法等。课题组以回收率为指标，考察了不同净化处理对农药的影响，其中直接提取法大多禁用农药基质效应大，好多禁用农药离子对检测不到，但没干扰的禁用农药回收率普遍较高；QuEChERS法禁用农药基质效应明显小，但没干扰的禁用农药回收率也会偏低；SPE法禁用农药基质效应更小，禁用农药回收率普遍会达到标准要求；最终选用HLB柱净化效果最佳[2-4]。

4.2 小结：随着中药的广泛应用，中药材的质量安全性是影响中药产品质量和药效的关键因素,同时也严重制约着中药的现代化和国际化发展。在中药材种植过程中农药的使用对防治病虫害,提高中药材产量和保证中药产业的经济效益起到了积极的促进作用,但是农药的长期使用和滥用不仅造成严重的环境污染,带有农药残留的中药材进入人体后,使得中药材本身的药效降低,同时农药本身严重损害着人体健康[5,6]。

依据2020版中国药典2341第五法，对五个不同产地的前胡进行研究，确保方法的行之有效，对中药禁用农药残留的质量保障提供有力的研究依据，同时对不同产地及不同基质的中药项目提供了有力的支持。