绞股蓝中黄酮类成分HPLC指纹图谱研究*

臧淦荣 向 文王 莉# 周 宁

1 长兴县中医院 浙江 长兴 313100

2 湖州市食品药品检验研究院 浙江 湖州 313000

绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum(Thunb)Makino的干燥地上部分，目前关于绞股蓝化学成分的研究主要集中皂苷类成分，对其中的黄酮类成分的研究较少。对绞股蓝总黄酮含量的测定目前主要有分光光度法、三波长-光谱法和高效液相色谱法。本实验采用高效液相色谱法建立绞股蓝黄酮类成分指纹图谱，并进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，旨在为绞股蓝的质量评价和资源的充分利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器：高效液相色谱仪（美国Waters公司）；十万分之一分析天平［XS205DU，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料：乙腈为色谱纯（德国Merck公司）；甲醇分析纯（南京化学试剂股份有限公司）；磷酸色谱纯（南京化学试剂股份有限公司）；对照品：芦丁（11086-202012，91.6%）、槲皮素（100081-201610，99.1%）、山柰素（山柰酚）（11086-202013，93.2%）均购自中国食品药品检定研究院；安徽和浙江两省23批绞股蓝样品来源信息见表1，经湖州市食品药品检验研究院陈敏主任中药师鉴定，均为葫芦科佛手瓜族绞股蓝属绞股蓝亚属绞股蓝原变种G.pentaphyllum var.pentaphyllum的地上部分。

表1 23批绞股蓝样品来源信息

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备：取绞股蓝样品粉碎，过二号筛，精密称取0.25g，置于150mL三角瓶中，精密加入80%乙醇25mL，密闭，称重，加热回流45min，冷却，再称重，用80%乙醇补足失重，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液的制备：取芦丁、槲皮素、山柰素对照品精密称定，置25mL棕色量瓶中，加80%乙醇制成每毫升含芦丁332.30μg，槲皮素88.07μg，山 柰 素42.11μg的混合溶液，即为混合对照品溶液。

2.3 色谱条件：色谱柱：Ultimate Plus C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.01%磷酸溶液（B）；梯度洗脱：0～8min，15%→20%A；8～30min，20%→35%A；30～35min，35%→40%A；35～40min，40%→70%A；40～45min，70%→100%A；45～50min，100%A；50～55min，100%→15%；检测波长：368nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.4 方法学考察：分述如下。

2.4.1 精密度试验：取绞股蓝样品S1，采用“2.1”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件连续进样分析6次，以3号芦丁色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.55%，相对峰面积RSD均小于1.95%；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行处理，与对照指纹图谱相似度均大于0.995，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验：取绞股蓝样品S1，采用“2.1”项下的方法制备6份供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样分析，以3号芦丁色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰相对保留时间RSD均小于0.95%，相对峰面积RSD均小于2.75%；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行处理，与对照指纹图谱相似度均大于0.990，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验：取绞股蓝样品S1，采用“2.1”项下的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24、36、48h进样测定，以3号芦丁色谱峰为参照峰(S)，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD小于1.95%，相对峰面积RSD均小于3.75%；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行处理，计算得到其与对照指纹图谱相似度均大于0.992，表明供试品溶液在48h内稳定性良好。

2.4.4 加样回收率实验：取已知含量的绞股蓝药材样品S1（24.32mg/g），称定6份样品份0.25g，精密称定，每份分别精密加入6mg的芦丁对照品，采用“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样分析计算，芦丁的平均回收率为98.23%，RSD为0.86%，表明该方法回收率良好。

2.5 指纹图谱的建立与评价：分述如下。

2.5.1 指纹图谱的建立：取23批绞股蓝样品，采用“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将所有数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以样品S1色谱图为参照图谱，设定时间窗宽度为0.2min，选择平均数法生成对照图谱，运用多点校正法对色谱峰进行匹配，生成叠加图谱及对照图谱。以S23样品图谱为参照进行指纹匹配，确定共有峰39个。通过对照品比对指认了3个色谱峰：芦丁、槲皮素、山柰素。

2.5.2 相似度评价：将23批绞股蓝样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，进行相似度评价，结果如表2所示。23批绞股蓝样品与对照图谱的相似度为0.928～0.995，说明不同产地间绞股蓝样品的质量存在一定的差异。安徽产地的绞股蓝样品相似度的RSD为2.23%，浙江产地的绞股蓝样品相似度的RSD为1.35%，表明同一产地绞股蓝样品也存在差异，浙江产地绞股蓝样品比安徽产地相对稳定。

表2 23批绞股蓝样品与生成对照图谱相似度评价结果

2.5.3 聚类分析：将23批绞股蓝样品色谱图数据导入SPSS 23.0软件，采用组间连接法，以余弦距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，结果当判别距离为5时，23批绞股蓝样品被分为4大类：安徽滁州S22、安徽旌德S23、安徽宣城S18、安徽黄山S14、浙江磐安S12、安徽六安S13、安徽新杭S15、安徽郎溪S16、安徽定远S21为一类，安徽芜湖S17一类，浙江诸暨S05和浙江临安S09为一类，其余11批样品被聚为一类。从整体来看，这23批绞股蓝的质量与产地相关性较小、组间距离较小，同一省份绞股蓝也可分在不同的组，与相似度评价结果一致。

2.5.4 主成分分析：利用SPSS 23.0软件对峰面积进 行标准化处理后，对23批绞股蓝样品指纹图谱所得的共有峰中峰面积较大的39个共有峰进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值及方差贡献率，见表3和表4。提取了6个因子的累计方差贡献率为93.93%，特征值均大于1，可代表绞股蓝指纹图谱39个共有峰的大部分信息，来计算主成分得分。对主成分载荷值进行计算，得出各主成分的线性模型：成分综合总得分M=0.29×Z峰1+0.31×Z峰2+0.45×Z峰3（芦丁）+0.25××Z峰4+0.47×Z峰5+0.23×Z峰6+0.64×Z峰7+0.46×Z峰8+0.49×Z峰9+0.58×Z峰10+0.49×Z峰11+0.31×Z峰12+0.73×Z峰13+0.16×Z峰14+0.30×Z峰15+0.77×Z峰16+0.37×Z峰17（槲皮素）+0.62×Z峰18+0.01×Z峰19+0.63×Z峰20+0.63×Z峰21（山柰素）+0.50×Z峰22+0.57×Z峰23+0.94×Z峰24+0.69×Z峰25+0.65×Z峰26+0.74×Z峰27+0.81×Z峰28+0.85×Z峰29+0.56×Z峰30-0.14×Z峰31+0.69×Z峰32+0.44×Z峰33+0.51×Z峰34+0.23×Z峰35+0.34×Z峰36+0.31×Z峰37+0.63×Z峰38-0.15×Z峰39，其中M代表综合主成分，Z峰1→Z峰39分别对应39个色谱峰峰面积的标准化数据。综合得分越高说明质量越好，绞股蓝样品综合得分情况如表5所示，浙江省的丽水、乐清、龙游、临安、磐安等地绞股蓝的评分较高，浙江省的湖州、江山、安徽省的宣城、定远等地绞股蓝评分均较低。从整体来看，安徽产地绞股蓝样品的得分分布相对集中，绞股蓝样品质量相对一致；浙江产地的分布区间较大，绞股蓝样品质量变化较大。

表3 主成分特征值及累计方差百分比

表5 绞股蓝样品综合得分表

以23批绞股蓝样品指纹图谱的39个共有峰峰面积为变量，采用SIMCAD 13.0软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）分析，结果标记出6个贡献较大的成分，依次为17（槲皮素）、27、28、29、30、37、38号色谱峰，导致了绞股蓝成分含量上的差异，因此在制定绞股蓝的质量标准时，采用多指标成分进行质量控制。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化：①检测波长的选择：绞股蓝中黄酮类有芦丁、山柰素（山奈酚）、商陆素、商陆苷、槲皮素、异鼠李素等。黄酮类成分的紫外吸收波段为300～400nm，通过二极管阵列检测器DAD全波段比较分析发现368nm下绞股蓝出峰较为丰富，各色谱峰响应值较高，基线较平，因此选择368nm作为绞股蓝高相液相指纹图谱的检测波长。②流动相：分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.1%醋酸酸溶液4种流动相体系，发现乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相时，色谱图基线较平稳，峰分离度较好。再次分别考察乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液3种流动相体系，最终选择乙腈-0.1%磷酸溶液为绞股蓝高相液相指纹图谱的流动相。

3.2 供试品溶液制备条件的优化：以芦丁、槲皮素、山柰素的提取率为指标，采用正交响应面法来确定绞股蓝样品的供试品溶液的制备方法。称样量：0.10g→25mL、0.20g→25mL、0.30g→25mL、0.50g→25mL；提取溶剂：甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇、80%乙醇、50%乙醇；提取方式：超声处理15min、超声处理30min、超声处理60min、加热回流15min、加热回流30min、加热回流60min。将试验结果通过方差分析找出最优组合为：称取绞股蓝样品0.25g，精密加入80%乙醇25mL，加热回流45min。

3.3 指纹图谱相似度评价：葫芦科绞股蓝属植物基源复杂、品类繁多，全球共有16种2变种，其中我国有14种2变种，是绞股蓝属植物中分布最广变化最大的一个种，有3小叶、5～7小叶和9小叶的类型，产陕西南部和长江以南各省区。来自浙江和安徽两省的23批绞股蓝样品与对照图谱的相似度为0.928～0.995，说明不同产地间绞股蓝样品的质量存在差异。但是所收集绞股蓝样品涵盖的地域范围较广数量有限，接下来研究中集中一定区域内的绞股蓝并结合绞股蓝皂苷类成分研究来用于绞股蓝的质量评价。

3.4 聚类分析：根据23批绞股蓝样品色谱图和含量测定结果可知，绞股蓝黄酮类成分和含量差异较大，仅通过相似度的比较尚不能完全体现绞股蓝品质的差异性，还进行聚类分析和主成分分析。同一省份绞股蓝也可分在不同的组，浙江产的绞股蓝分布在3个组中，安徽的也分布3个组其中有个产地单独为一组（安徽芜湖S17），与相似度评价结果一致。