酶底物法检测医疗机构废水中粪大肠菌群的适用性分析

林 健

(福州市台江环境监测站，福建 福州 350004)

0 引言

粪大肠菌群是指具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，它不是按细菌分类学命名，而是卫生细菌领域的用语，指的不是某一种或某一属细菌，而是一类生长于人和温血动物肠道中的一组细菌，能够适应较高的培养温度，是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便[1]。北美国家的研究文献着重强调其粪性来源，多使用“粪大肠菌群”的叫法，而欧洲国家则强调其对温度的耐受性方面特点，能够适应较高的培养温度，称其为“耐热大肠菌群”。我国对它的定义随着标准和检测方法的不同而变化，《水和废水监测分析方法》(第四版)对粪大肠菌群的定义为“在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群”；酶底物检测法则利用其方法原理，将粪大肠菌群定义为“44.5℃培养24小时，能产生β-半乳糖苷酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌”。

医疗污水指医疗机构门诊、病房、手术室、各类检测室、病理解剖室、放射室、洗衣房、太平间等处排出的诊疗、生活及粪便污水，当医疗机构其他废水同上述污水混合排出时一律视为医疗机构污水[2]。不同于其他污水，医疗废水成分复杂，含有大量细菌、病毒等微生物，具有一定的传染性和细胞毒性。在实际工作中，对水体所有可能的致病微生物进行检测不太现实，一般会选择检测某一类具有代表性的微生物作为指示菌，以反映水体被污染的程度。而医疗废水中的粪大肠菌群可以作为一种特征指示菌，因该病菌可能导致肠道病毒的传播，如伤寒、霍乱和传染性肝炎等，是医疗机构污染物排放情况的重要监测指标，广泛应用于水体卫生质量的评价。

目前国内外有多管发酵法、滤膜法、纸片法、酶底物法等多种方法检测水中的粪大肠菌群，这些方法各有优劣势，适用范围也有所区别。其中多管发酵法和酶底物法在结果表示上均使用一种基于泊松分布的间接计数MPN法，简单地说就是利用细菌在水体中是随机分布的特性，根据统计学概率理论，通过查表估算一定体积水样中目标微生物的浓度。这两种方法检测原理不同，多管发酵法从活性细菌的生化反应进行判断，而酶底物法根据酶原反应进行判断。由于在《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》(HJ 1001—2018)中的适用范围未明确酶底物法可用于检测医疗机构废水，环境检测机构在开展此类检测工作中，普遍采用《医疗机构水污染物排放标准》(GB 18466—2005)中的附录A多管发酵法或者与附录A方法原理相同的可适用于医疗机构废水监测的《水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法》(HJ 347.2—2018)[3]。但是多管发酵法检测周期长，操作步骤繁琐，需要确认实验。相对而言，酶底物法可使用成品培养基，操作简单、耗时短、结果可靠，可以很大程度省去前期培养基准备和玻璃仪器清洗的人力和时间，实验废物易集中灭菌处理，被世界各国和各组织机构广泛应用于水质检测[4]。

本文应用多管发酵法和酶底物法同时检测医疗机构废水中粪大肠菌群，通过分析所得的试验统计数据，开展技术等效性验证，讨论酶底物法的适用性。

1 实验部分

比对试验中用到的培养基、试剂、仪器设备和方法等分别按照《水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法》(HJ 347.2—2018)15管法和《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法》(HJ 1001—2018)准备和测定。

1.1 主要材料与设备

仪器和设备参数见表1、表2。

表1 实验仪器情况

表2 实验设备情况

1.2 水样来源

为确保水样具有代表性，本次医疗机构废水选取自辖区内两家床位数1000张以上的大型三甲医院、两家床位数约150张的二乙医院，以及两家床位数约30张的专科医院。因疫情期间，医疗机构均加大消毒力度，总排放口出水的粪大肠菌群数普遍偏低，为保证数据具有统计意义，水样应有足够的阳性检出率，部分水样为消毒工序前后以适当比例混合的废水，共采集废水样36份。

1.3 实验与数据分析

1.3.1 试验一

方法的技术等效性主要是通过两种方法检测同一样品，分析检测结果的精密度和正确度是否存在显著性差异[5]。因此本试验设计对其中1份医疗废水样采用多管发酵法15管法和酶底物法分别在重复性条件下进行6次检测，测定结果见表3。

表3 多管发酵法与酶底物法重复性测定结果

表4 F检验结果

采用t检验法比较这两组数据平均值的一致性，由表5得到t统计值

表5 t检验结果

1.3.2 试验二

对36份医疗机构废水分别严格按照多管发酵法15管法和酶底物法开展试验分析，检测水中的粪大肠菌群，测定结果见图1，线性回归情况见图2。由图2可得，两种方法检测结果的相关系数r=0.984，表明多管发酵法结果和酶底物法结果呈显著的正向影响关系，两组数据有较好的趋势性。

图1 多管发酵法与酶底物法检测结果

图2 多管发酵法与酶底物法线性回归分析

运用SPSS统计工具对多管发酵法与酶底物法检测粪大肠菌群的结果分别进行线性回归分析和配对t检验分析，由表6可知，标准化回归系数β值为0.984，非标准化回归系数B达到0.986，回归系数t检验为31.915，将多管发酵法作为自变量，意味着多管发酵法可以解释酶底物法的96.8%变化原因。表7配对t结果表明，多管发酵法与酶底物法检测结果的P值为0.103，大于0.05，两种方法的检测结果无显著性差异[6]，可以认为两种方法在检测医疗废水中的粪大肠菌群技术上是等效的。

表6 多管发酵法与酶底物法检测结果的线性回归分析

表7 多管发酵法与酶底物法的配对t检验结果

2 讨论

为减少试验误差，需做好以下质量控制工作:①本试验检测对象粪大肠菌群是微生物活体，其增长繁殖是以几何级数量递增的，因此多管发酵法与酶底物法的比对试验应同时开展；②在制作试管培养基过程中，经常会出现小导管中有气泡的问题，影响结果判读，可使用透气性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。高温蒸汽灭菌锅应自然冷却至内外压力和温度平衡时再打开锅盖；③水样分析前，应调节样品的pH值，并确认培养基和无菌水的pH值，避免多管发酵法试验结果出现假阳性或者假阴性的情况；④多管发酵法复发酵试验时，应在转接培养物后30min内放进提前预热的恒温培养箱，否则非目标菌的生长繁殖可能导致假阳性，影响试验结果；⑤微生物在环境水体中的分布是不均匀的，在分样前应确保水样混合均匀，使用涡旋振荡器可以达到混匀效果，同时避免手摇混匀导致的样品或环境污染；⑥温度对微生物的生长繁殖影响很大，在培养过程中可使用在线温度监控设备监控培养箱的运行状况，确保温度波动在合理的区间范围。

3 结论

通过以上两组试验证明，多管发酵法和酶底物法的检测结果无统计学意义上的差异，两种检测方法是等效的，酶底物法可以用于医疗废水中的粪大肠菌群的检测。由于酶底物法操作简便、反应专业性强、假阳性率低，能够用于大批量水质检测工作，快速评价各类水体受污染的状况，同时减少环境污染和人员感染的风险，对预报、预防和控制流行疾病传播具有重要的现实意义。