V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C与脑静脉窦血栓抗凝有效性相关性分析

卢飞虎，于 雪

(1.蚌埠市第三人民医院神经外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院第一附属医院妇科肿瘤)

脑静脉窦血栓(cerebral venous sinus thrombosis，CVST)发病率相对较低，占脑血管病的0.5 %～1 %[1]，以青年人好发，尤其是育龄期女性[2]。CVST原发因素多由遗传引起，包括V因子Leiden突变、抗凝蛋白缺乏及蛋白S、蛋白C低下等[3]，目前有关V因子Leiden突变引发血液高凝状态的机制尚不明确。有研究显示V因子Leiden突变可能导致蛋白C无法对其水解，使其凝血活性无法被灭活，导致血液处于高凝状态[4-5]；蛋白C、蛋白S是凝血级联反应过程中重要的抑制物，在血液抗凝调节中发挥着重要作用，其表达低下或者缺陷导致血栓形成风险增高。目前对抗凝药物效果评估和检测相对客观准确的方法主要有凝血功能指标、血栓弹力图(thromboelastogram，TEG)[6-7]。目前临床对于CVST的治疗缺乏对相关指标的监测[8]，对于静脉血栓的抗凝治疗很难能做好综合评价抗凝药物疗效，缺乏对相关凝血指标的监测，很难通过客观的临床实验室检查指标来评估和预判血凝的变化趋势，不能给予CVST患者提供个体化的抗凝治疗方案。本研究通过对V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下与脑静脉窦血栓抗凝有效性的相关分析，临床上根据CVST患者发病因素对抗凝治疗的有效性做出评估和预判，意在为临床CVST患者提供合适有效的抗凝治疗方案。

1 对象与方法

1.1对象 选取2017年5月至2022年2月蚌埠市第三人民医院收治的脑静脉窦血栓的103例患者为研究对象。纳入标准：通过医学影像学检查如(头颅CT或CTV及头MRI或MRV)临床确诊为脑静脉窦血栓，且给予规范抗凝治疗。排除标准：发病时间>1周；严重的肝肾功能异常；孕妇及哺乳期妇女；有血液系统疾病伴有血小板降低；近3个月内接受外科手术或是心肺复苏；有活动性出血、恶性肿瘤等其他严重系统性疾病。根据DNA检测及酶联免疫吸附沉淀检测判定患者是否存在V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C水平低下，分别以单纯V因子突变为观察A组33例，单纯蛋白S、蛋白C低下为观察B组34例，无V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下为对照组36例，三组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组患者一般资料对比情况

1.2方法 研究对象均需要基因组DNA提取试剂盒(杭州凯莱酶生物科技有限公司)提取患者DNA，使用变性琼脂糖凝胶电泳方法对提取的DNA定量和稀释，通过PCR扩增仪对V因子相关的基因片段扩增，然后进行荧光检测，对扩增DNA产物完成DNA序列测定判断有无Leiden突变；用酶联免疫吸附沉淀对蛋白S、蛋白C进行测定判断(蛋白S<19.0 μg/mL、蛋白C<3.0 μg/mL为低下)；对于确诊CVST患者在发病1周内予以皮下注射低分子肝素，在皮下注射低分子肝素抗凝治疗1周时选用口服利伐沙班药物(南京正大天晴制药公司，规格10 mg/片)来替代皮下注射低分肝素，一次给药剂量10 mg/片，1次/d，药物在每日早餐后口服；在入院时及抗凝治疗第3、7、15 d分别进行血栓弹力图参数凝血反应时间(reaction time, R)、血凝块形成速率(clot kinetics，K)、最大血凝块强度(maximal amplitude，MA)监测及凝血功能指标国际标准化比值(international normalized ratio，INR)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)监测。

1.3观察指标 记录各组患者在入院时及在抗凝治疗第3、7、15 d时弹力血栓图R值、K值、MA值及相应的凝血功能指标INR、APTT。

2 结果

2.1三组入院时R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三组患者在入院时抗凝治疗前行弹力血栓图参数R值、K值、MA值及INR、APTT水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表2 三组入院时R值、K值、MA值及INR、APTT结果

2.2三组抗凝治疗3 d时R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三组患者在抗凝治疗3 d时弹力血栓图R值、K值、MA值及INR、APTT水平比较，观察A组在R值、K值、INR和对照组及观察B组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；观察B组仅在R值、K值与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表 3。

表3 三组抗凝治疗3 d时R值、K值、MA值及INR、APTT结果

2.3三组抗凝治疗7 d时R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三组患者在抗凝治疗7 d时血栓弹力图R值、K值、MA值及INR、APTT水平比较，观察A组在R值、K值、MA、INR及APTT水平上和对照组及观察B组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；观察B组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4。

表4 三组在抗凝治疗7 d时R值、K值、MA值及INR、APTT结果

2.4三组抗凝治疗15 d时R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三组患者在抗凝治疗15 d弹力血栓图R值、K值、MA值及INR、APTT水平比较，观察A组在R值、K值、INR和对照组及观察B组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，观察B组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 三组抗凝治疗15 d时R值、K值、MA值及INR、APTT结果

3 讨论

机体在正常条件下，促凝系统、纤维溶解系统及血管内皮细胞的分泌等共同参与维持体积内凝血和抗凝达到动态平衡，此平衡被机体内在或外在因素打破时，机体会启动自身凝血或抗凝机制并给予相应的调节；当发生血栓时，在给予外界干预的同时机体也会通过自身调节机制来实现血栓的溶解[9]。国内外指南均指出在CVST患者发病1～2周给予皮下注射低分子肝素抗凝治疗[10-11]，在CVST患者发病后1～2周后由口服抗凝药逐渐替代低分子肝素，将CVST患者的抗凝治疗仍作为临床基础治疗[12]。利伐沙班药物主要与相关的底物来竞争Ⅹa因子自身的相关活性中心来阻碍底物与活性中心的结合，并阻碍凝血酶的进一步生成，为国内目前最常应用的新型抗凝药物。Patel等[13]研究并讨论了新型抗凝药物在治疗静脉血栓形成中的临床应用，其相对传统华法林抗凝更有优势；在常规抗凝治疗中不需要频繁调整口服药物剂量，而且其出血风险相对华法林更低[14]。

V因子Leiden突变为第1 691位，V因子的10位外显子由原来的鸟嘌呤错译为腺嘌呤，使谷氨酸取代原位的精氨酸。V因子突变在正常人的发病率为2 %～10 %，在有血栓的病人发病率高达20 %～50 %，目前对于V因子Leiden突变引发血液高凝状态的的机制尚不明确。有研究显示V因子Leiden突变后，导致该部位的促凝活性不能被活化蛋白C抵抗性(APC)水解失活，使血液处于高凝状态[3]，随着不断对V因子Leiden突变与血栓发生机制的深入研究，研究者发现了APC与V因子Leiden突变存在着关联，APC是目前被认为最高的一种血栓风险因素，但对APC在血栓形成的病理生理机制尚未清楚，但可以肯定APC在静脉血栓的发生和形成中起重要作用。蛋白S、蛋白C在人体抗凝平衡调节中发挥着重要作用，其表达低下或者缺陷可能与患者机体内抗凝蛋白先天缺陷[15-16]相关，两种蛋白均为VitK依赖止血蛋白，均由肝脏合成[17]。有研究表明蛋白S发挥作用时是将蛋白C进一步活化[18]，蛋白C是凝血级联反应过程中重要抑制物，同时蛋白C在血管内皮细胞稳定、促进纤维溶解及抗凝平衡上发挥重要作用[19-20]。利伐沙班主要对Xa因子发生作用，影响凝血酶原复合物(Xa+V+Ca2++PF3)的形成，当V因子Leiden突变后可能在参与底物竞争Ⅹa因子相关活性中心中更有优势，导致Xa+V+Ca2++PF3合成增加，从而使利伐沙班药物抗凝的效果较差；有报告称V因子Leiden突变可引起蛋白C抗凝路径受抑制，增高静脉血栓发生风险，但目前缺乏中心实验对相关机制研究[21]。对于CVST的发病因素有基因缺陷者的研究仅分析了V因子Leiden突变及蛋白C、蛋白S，仍不能排除其他基因突变导致患者出现抗凝异常的发生，随着将来对APC的不断认识，还可能会发现更多的基因片段的参与或者APC与这些凝血因子之间复杂的级联反应。本研究显示观察A组在抗凝治疗第3、7、15 d时，血栓弹力图R值、K值及凝血功能指标INR、APTT水平低于对照组，血栓弹力图MA值水平高于对照组，差异具有统计学意义，对于存在V因子Leiden突变的患者行抗凝治疗效果较差；观察B组仅在抗凝治疗第3 d R值、K值水平低于对照组，差异有统计学意义，对于CVST早期抗凝治疗有效对CVST进一步增加有重要意义，可以减少CVST相关并发症及不良预后事件的发生；显示出观察B组在抗凝治疗3 d的效果稍要差于对照组，优于观察组A；但在抗凝治疗7、15 d时，在血栓弹力图参数及凝血功能INR、APTT水平上，观察组B与对照组相比，差异无统计学意义，对于蛋白S、蛋白C低下的患者行抗凝治疗效果较好，对于无V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下的患者抗凝治疗效果最好。对于检查明确存在基因缺陷的患者发生CVST时，可能需要更长时间的抗凝治疗来弥补抗凝治疗效果不理想等问题的不足，但对该类患者属于CVST的易发人群，需不需要通过更长时间的抗凝来预防血栓的发生，这可能与无基因缺陷的患者所采取的抗凝策略有所不同，一方面为抗凝治疗时间的选择，另一方面为抗凝药物的选择，这些问题均将可以为CVST患者提供个体化的抗凝方案寻找出路。

综上所述，V因子Leiden突变及蛋白S、蛋白C低下与脑静脉窦血栓抗凝效果存在相关性，希望通过此研究对CVST患者根据患者发病因素在抗凝的效果上做出评估和预判，但该研究为小样本研究，缺乏多中心研究数据对结果进行证实，相信未来可以具体到更多在基因表达层面上为CVST患者提供合适抗凝治疗方案，同时也希望更多的新型抗凝药物能够使更多CVST患者获益。