应用网络药理学结合分子对接技术探讨四神煎对膝骨关节炎和类风湿性关节炎的“异病同治”机制

钟贤兴， 安镇南， 高丰禾， 吴春飞， 范帅， 梁祖建

（1.广州中医药大学第三临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第三附属医院，广东广州 510240）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）和类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）都是骨伤科、风湿免疫科常见的关节疾病。2种疾病的发病特征均具有病因复杂、病症多样化、病程迁延等特点，临床表现多为关节疼痛、肿胀、畸形、活动受限，严重影响患者的生活质量[1]。骨关节炎（osteoarthritis，OA）是累及整个关节的慢性退行性疾病，而KOA在临床最常见，主要表现为膝关节疼痛与活动受限[2]。RA是以关节滑膜炎、炎性骨破坏为主要特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，临床表现为全身多发骨关节病变、关节畸形、晨僵等[3]。现阶段，KOA和RA的治疗仍缺乏特效药物及方法，临床疗效仍不理想。随着中医药研究的不断发展，中医药在治疗KOA、RA方面显现出多靶点干预与安全有效的独特优势，具有深厚的临床实践基础。

四神煎出自清代鲍相璈《验方新编》“病在筋则伸不能屈，在骨则移动多艰，久则日粗日肿，大腿日细，痛而无脓，颜色不变，成败症矣，立方四神煎。”方中：重用黄芪为君，匡扶正气以蠲痹除滞；牛膝强健筋骨，通利关节，尤善治膝关节屈伸不利；金银花清热解毒，消瘀化热，治疗关节肿痛；远志可祛痰消肿；石斛可养阴生津。该方用药虽仅5味，但组方严谨，既补已损之气阴，又驱除经络之郁邪，补而不滞，清而不寒；药简而量大，功专而效宏。近代著名中医家岳美中先生盛赞此方为治疗膝痹的专病专方，其言“鹤膝风，膝关节红肿疼痛步履维艰，投以《验方新编》四神煎恒效”“历年来余与同人用此方治此病，每随治随效，难以枚举”。随着四神煎应用范围的扩大，临床报道可见医家用其治疗RA、膝关节滑膜炎、强直性脊柱炎、糖尿病周围神经病变[4]，疗效显著，凸显了中医药异病同治的独特优势。但中药成分复杂，关于四神煎的物质基础及其治疗KOA及RA的作用机制仍未阐明。故本研究基于网络药理学“整体观”的研究方法，构建“疾病-通路-靶点-药物”的多级网络，从多角度分析并阐述四神煎组方中药的主要活性成分和KOA、RA的关联性，以期进一步拓展四神煎异病同治的科学内涵，为临床推广应用和深入研究提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1药物有效活性成分及靶点的筛选应用TCMSP数据库（http://herb.ac.cn/）检索黄芪、牛膝、远志、石斛、金银花的化学成分，根据检索结果，按ADME原则[口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，药物半衰期（half-life，HL）≥4]进行筛选，获得其活性成分，并预测其对应靶点。将筛选所得所有靶蛋白名称导入UniProt数据库（https://www.uniprot.org），设置物种为人类（Homo sapiens），对得到的靶蛋白进行比对和基因名校正，转换成标准的基因名，并删除无对应基因名的靶蛋白。对未检索到的中药“石斛”“远志”，分别从BATM-TCM数据库、HERB数据库（http://herb.ac.cn/）检索相关化学成分，并通过文献检索对所有药物的有效活性成分进行完善，然后通过PubChem数据库获取化合物的2D结构，导入SwissADME得到其SMILES。同样根据ADME原则进行筛选，对筛选出的化合物通过SwissTargetPrediction数据库进行预测，获取其对应靶点。

1.2药效成分-靶点互作网络构建利用Cytoscape 3.7.2软件构建四神煎-有效活性成分-靶点互作网络。利用Cytoscape 3.7.2软件中的“Networkanalyze”功能进行网络拓扑学分析，筛选得出核心活性成分及潜在靶基因。

1.3疾病靶点获取通过Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库分别检索“Knee Osteoarthritis”“Rheumatoid Arthritis”，得到KOA、RA相关疾病靶点，并将3个数据库所得靶点分别合并、去重，再利用Uniprot数据库匹配已验证的人类靶点基因名。

1.4活性成分与疾病的共同靶点筛选及PPI网络构建明确KOA、RA相关靶点与药物潜在靶点之间的相互作用，应用R语言（https://www.r-project.org/）软件及Perl语言程序将疾病靶点与药物靶点进行交集，并输入Venny 2.1软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图。应用STRING数据库（https://string-db.org/）分别构建共同靶点互作网络（protein-protein interaction，PPI），将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，将Settings设为“high confidence：0.9”，并隐藏无关系的靶点，其他参数保持默认设置，获得PPI网络。应用Count.R插件获得共同蛋白靶点出现的频次。进一步通过Cytoscape 3.7.2软件（https://cytoscape.org/）得到潜在靶基因的PPI网络模型，对PPI网络进行拓扑分析以筛选关键靶点。

1.5疾病-方药-成分-靶点互作网络构建通过Cytoscape 3.7.2软件构建疾病-方药-成分-靶点互作网络，以探究药物的潜在药理学作用机制。网络图中“node”代表方药、疾病、活性成分和靶点，“edge”代表活性疾病-方药-成分-靶点之间的相互关系。

1.6基因本体论（GO）生物功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集应用R语言（https://www.r-project.org/）软件中clusterProfilerGO.R包及Perl语言对活性成分与KOA、RA的共同靶点分别进行GO分析。GO分析主要用于描述基因产物的功能，其中包括细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物学过程（biological process，BP）。并应用clusterProfilerKEGG.R包进行KEGG通路富集分析，同时，利用pathview包绘制相应的信号通路图。根据富集因子值分析核心通路富集程度，探究四神煎治疗KOA、RA可能的生物功能及信号通路机制。

1.7分子对接验证为探究前期网络药理学筛选的按照度值排列前4位的有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F与KOA、RA相关核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8之间的互作关系，对二者进行分子对接验证。从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载有效活性成分的结构式，利用Chem 3D软件制作相应的3D结构，并输出为mol*2格式，再从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载核心蛋白结构域的pdb格式，利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作。利用AutoDockTools 1.5.6软件将药物活性成分及核心蛋白基因文件pdb格式转换为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后运行Vina脚本进行分子结合能计算以及分子对接结果展示。同时运行Discovery Studio（DS）2019寻找对接位点并计算柔性结合的LibDockScore，将输出的分子对接结果导入PyMOL软件进行分子对接构象展示。若结合能小于0说明配体与受体可自发结合，当Vina结合能≤-5.0 kcal·mol-1以及LibDockScore＞100，说明两者形成稳定对接。对配体-受体复合物进行分子对接结果3D展示，以评价生物信息分析预测的可靠性。

2 结果

2.1药物有效成分和对应靶点及其互作网络构建通过TCMSP数据库、BATM-TCM数据库、HERB数据库（http://herb.ac.cn/）以及文献检索，经ADME原则筛选后获得四神煎有效成分67种，其中共有成分4种。黄芪、金银花、牛膝、石斛、远志有效成分分别为16、17、18、11、11种，黄芪、金银花、牛膝共有成分2种，金银花、牛膝共有成分2种。结合SwissTargetPrediction，得到药物靶点230个。采用Cytoscape 3.7.2软件构建四神煎-有效活性成分-靶点互作网络，共获得303个节点（其中靶点156个，活性成分67个），1 000条边，结果见图1。

图1 四神煎-有效活性成分-靶点互作网络Figure 1 Sishen Jian-active component-target interaction network

2.2疾病靶点筛选通过检索GeneCards、OMIM、TTD数据库分别得到KOA、RA的相关靶点2 116、5 088个，分别去重后，共获得KOA疾病靶点2 110个，RA疾病靶点5 058个。

2.3共同靶点筛选及互作网络构建得到的230个四神煎药物活性成分靶点与2 110个KOA相关疾病靶点、5 058个RA疾病相关靶点分别导入在线韦恩图制作网站InteractiVenn，相匹配映射得到中药治疗KOA的潜在作用靶点115个，治疗RA的潜在作用靶点147个。将治疗KOA、RA的潜在靶基因导入STRING在线分析网站（https://string-db.org/），设置隐藏未连接的靶点，设定最低互作评分中的“highest confidence>0.900”，并导出PPI结果数据。进一步通过Cytoscape 3.7.2软件分别得到治疗KOA、RA潜在靶基因的PPI网络模型，运用其中的cytoHubba插件筛选Hub基因，使用Degree算法，得出排名前20位的潜在核心靶基因，通过CytoNCA插件分析网络并限定Degree、BC、CC、NC、LAC值均大于等于中位数，得到PPI核心网络，结果见图2。

图2 四神煎治疗膝骨关节炎（KOA）、类风湿性关节炎（RA）的PPI核心网络Figure 2 PPI core network of Sishen Jian in treating KOA and RA

2.4疾病-方药-成分-靶点互作网络构建互作网络构建采用Cytoscape 3.7.2软件在构建KOA/RA-四神煎-成分-靶点互作网络，共获得214个节点（其中靶点156个，活性成分55个），909条边，结果见图3。

图3 膝骨关节炎（KOA）/类风湿性关节炎（RA）-四神煎-成分-靶点互作网络Figure 3 Interaction network of KOA/RA-Sishen Jian-component-target

2.5药物治疗KOA、RA的生物功能（GO）分析及核心通路筛选运用R语言中的Bioconductor包、clusterProfiler包分别对中药治疗KOA的115个潜在作用靶点、治疗RA的147个潜在作用靶点进行GO和KEGG通路富集分析，结果显示：治疗KOA的115个潜在靶基因GO分析可见其主要富集于DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、内肽酶活性等；治疗RA的147个潜在作用靶点GO分析可见其主要富集于DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样白连接酶结合等。见图4。而KOA的潜在作用靶点KEGG通路富集分析发现其主要集中于脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体激活、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路、TNF信号通路，RA的潜在作用靶点KEGG通路富集分析发现其主要集中于脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体激活、PI3K-Akt信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK信号通路，见图5。

图4 GO功能分析气泡图Figure 4 Bubble diagram of GO function analysis

注：A.膝骨关节炎（KOA）；B.类风湿性关节炎（RA）

2.6分子对接结果表1结果显示：槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F与蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8形成稳定对接，其结合能均低于-5.0 kcal·mol-1（其中石斛苷F与蛋白MAPK14结合能大于-5.0 kcal·mol-1）。有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F分别与核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8的受体-配体进行柔性对接，结果显示，DS软件均能找到对接位点且MAPK14与槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F，EGFR与石斛苷F，MAPK8与槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F形成的对接模型LibDockScore均大于100，其余均小于100。综合分析发现，核心蛋白MAPK14与山柰酚，EGFR与石斛苷F，MAPK8与槲皮素形成最稳定的对接模型。由于蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8与不同活性成分在不同氨基酸位点形成不同的氢键及疏水键联系，因此彼此，形成不一样的对接体。最后，利用Vina输出的化合物结果导入Pymol中以及利用Discovery Studio 2019软件，与蛋白配体进行三维分子对接展示，见图6。

图6 分子对接3D模型Figure 6 3D model of molecular docking

表1 分子对接Vina、Discovery Studio 2019结果Table 1 Molecular docking results of Vina and discovery studio 2019

3 讨论

“异病同治”源于《黄帝内经》，确立于《伤寒杂病论》，至今仍指导着中医临床诊断及治疗。根据KOA、RA的临床表现，当归属于中医学之“骨痹”“尪痹”的范畴，其主要病因病机为素体亏虚，复加外感风、寒、湿、热之邪而致经脉阻塞、气血不畅，气血痰湿壅滞于关节，导致关节肿胀疼痛[5]。相关研究表明，OA与RA可能存在共同发病的机制，且受共同的因子调节（如TC蛋白、线粒体等）[6-8]。另外，最近研究发现，褪黑素可能通过调节昼夜节律进而缓解关节炎症反应[9]。基于此，KOA与RA的中医证候和西医发病机制均有共通点，采用相同方药进行治疗有其理论依据与现实意义，本研究采用网络药理学和分子对接对其进行分析和验证。

本研究基于网络药理学，筛选出67种四神煎药物活性成分，共预测获得四神煎治疗KOA的潜在作用靶点115个，治疗RA的潜在作用靶点147个，经共有靶点PPI网络构建，结合网络拓扑分析方法筛选出关键靶点和核心网络，最终获得四神煎治疗KOA的关键靶点有：MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6、VEGFA、IGF2；治疗RA的关键靶点有：RELA、EGFR、MAPK8、CCND1、IL6、FOS、MAPK14、CTNNB1。其 中MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6是四神煎治疗2种疾病共有的关键靶点。MAPK8和MAPK14属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，MAPK主要涉及癌症和炎症类疾病。目前，关于MAPK和RA的研究较为充分，MAPK不仅能调节促炎细胞因子在关节组织中的产生，而且在IL-1、IL-17和TNF-α受体下游的信号级联中发挥重要作用[10]。JNK MAPKs还能通过基质金属蛋白酶（MMP）介导的软骨破坏导致RA的发生[11]，p38MAPK可调节IL-17信号转导途径，以及促炎细胞因子和介质的释放[12]。EGFR同样在RA的发病中发挥重要作用，研究显示，EGFR信号的激活是RA中滑膜成纤维细胞增殖的原因。EGFR及其配体还可以在RA发病机制期间诱导滑膜成纤维细胞的细胞因子产生[13]。此外，还有研究发现，RA与血清EGFR蛋白的水平升高有关[14]。CCND1属于细胞周期蛋白家族，CCND1是Wnt信号通路中的关键蛋白，Wnt通路在RA的发病机制中起着重要作用，该信号通路的激活可导致滑膜细胞增殖，促进滑膜增生，导致骨损伤，破坏关节功能[15]。同时，Wnt通路还可以通过调节成骨细胞和破骨细胞的平衡来调节骨形成[16]。IL-6参与的炎症途径也是RA发生和进展的部分原因，IL-6在破骨细胞介导的骨吸收中起着至关重要的作用，这些过程有助于IgM和IgG类风湿因子以及瓜氨酸肽抗体的产生，瓜氨酸肽抗体在RA中特征性增加[17]。靶向IL-6治疗RA已被证明是有效的，多种IL-6靶向药物已应用于临床或处于研发阶段[18]。综上可知，这些关键靶点与KOA和RA的发生发展密切相关。

GO富集分析结果显示，四神煎对KOA的作用靶点主要通过调节DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、内肽酶活性等过程，对RA的作用靶点主要涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等过程。

KEGG通路分析结果显示，四神煎治疗KOA的潜在作用靶点主要富集于TNF信号通路。该通路是参与全身炎症反应的重要通路之一，TNF信号通路的关键分子TNF-α在关节细胞的代谢调节中是主要参与者[19]。文献研究结果显示，TNF-α与KOA、RA疾病的进展密切相关，TNF-α对于KOA、RA具有重要的疾病预测价值[20-22]。四神煎治疗RA的潜在作用靶点主要富集于PI3K/AKT信号通路。文献显示，PI3K/AKT通路在软骨细胞增殖、凋亡和基质重塑中起重要作用，与KOA的发生有密切联系[23]。PI3K/AKT信号通路不仅参与滑膜成纤维细胞的异常增殖和滑膜炎症，还影响破骨细胞的分化和生成。破骨细胞通过PI3K/AKT信号通路迁移、破坏骨骼和关节软骨，最终导致关节畸形，加重RA的发展[24-25]。

本研究根据“疾病-方药-成分-靶点”网络分析得到前4个核心活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F与核心靶点MAPK14、EGFR、MAPK8进行结合能力预测。分子对接结果显示，核心蛋白MAPK14与山柰酚，EGFR与石斛苷F，MAPK8与槲皮素形成最稳定的对接模型。槲皮素是一种天然抗氧化剂，具有淬灭自由基保护细胞免受损害的作用[26]。研究显示，槲皮素具有抗关节炎的作用，其机制可能涉及抑制氧化应激、细胞因子和COX-2的产生、蛋白多糖的降解以及多个相关信号通路的激活[27]。山柰酚是一种黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用，其可通过下调miR-146a激活PI3K/AKT信号通路，抑制促炎因子的释放，发挥抗骨关节炎的作用[28]。石斛苷G和石斛苷F属于萜类成分，就目前研究来看，尚缺乏这2种成分抗关节炎的药理学机制研究，本研究也为将来石斛苷G和石斛苷F抗关节炎的机制研究提供了参考。

综上所述，四神煎中存在槲皮素、山柰酚、石斛苷G、石斛苷F等活性成分，这些成分可作用于MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6等靶点对KOA和RA进行干预，其主要机制可能涉及TNF信号通路、PI3K/AKT通路等。同时，关键活性成分与关键靶点能形成较为稳定的对接模型，这为四神煎的临床应用及后续实验研究提供了参考依据。另外，本研究尚存在一些局限性：首先，本研究是建立在“成分-靶标-疾病”网络的分析，仅限于对四神煎整体机制的预测，仍无法确定不同配比、人体代谢前后组分中药含量、成分种类差异等；其次，由于筛选条件限制，研究中分析的是四神煎的主要成分及靶点，或许不能全面覆盖具有实质作用的成分；最后，基于网络药理学虽能获得大量靶点与机制，但国内相关动物实验研究较少，仍需结合实验进一步验证。