中药外用治疗急性软组织损伤用药规律文献研究及其核心药物乳香-没药网络药理学机制分析

何富平， 李亨， 谢辉， 蒋顺琬

（1.广州中医药大学第四临床医学院，广东深圳 518033；2.深圳市中医院，广东深圳 518033）

急性软组织损伤（acute soft tissue injury，ASTI）是指在外力的作用下而致的局部皮下软组织产生的急性挫伤或撕裂伤。急性软组织损伤包括肌肉、韧带、筋膜、肌腱、滑膜、关节囊、周围神经和血管的急性损伤，临床主要表现为疼痛、肿胀、青紫瘀斑、肢体功能障碍等症状，常发生于日常生活、体育运动、军事训练等场景[1]。目前临床治疗急性软组织损伤主要采用口服或局部使用非甾体类抗炎药以缓解患者症状，但这类药物对肝肾功能及胃肠道功能有一定的损害[2]。近年来的研究表明，与非甾体类抗炎药相比，中药外用治疗急性软组织损伤具有疗效确切、不良反应少、患者接受程度高、适应人群广等优点[3]。但到目前为止，中药外用治疗急性软组织损伤的用药规律及作用机制尚未明确。本研究通过收集近30年中药外用治疗急性软组织损伤的临床文献，运用古今医案云平台（Version 2.3.5）总结其用药规律，筛选核心药物，再运用网络药理学分析核心药物治疗急性软组织损伤的潜在基因靶点及信号通路，以期为临床治疗急性软组织损伤提供思路和参考。

1 资料与方法

1.1文献资料的收集检索策略采用“急性软组织损伤”OR“急性扭伤”OR“急性筋伤”AND“中药外用”OR“中药外敷”OR“中药外洗”OR“中药熏蒸”；检索中国知网（CNKI）、万方数据（Wanfang Data）、维普中文科技期刊数据库（VIP）等数据库中收录的有关中药外用治疗急性软组织损伤的临床研究文献。文献检索时间限定为1991年6月至2021年6月。

1.2文献资料的筛选文献资料符合以下纳入标准：（1）所选文献均为中药外用治疗急性软组织损伤的临床研究文献，包括临床疗效观察、临床试验研究、治疗体会等；（2）明确诊断为急性软组织损伤的患者，其性别、年龄、种族均不作限制；（3）有明确疗效标准且总有效率达90%及以上的临床研究；（4）以中药外用为主，可结合其他治疗方法（如针灸、推拿、功能锻炼等）；（5）所纳入的研究中，中药外用有完整的药物组成。

排除以下文献资料：（1）采用其他非中药外用为主要方法治疗急性软组织损伤的临床研究文献；（2）综述、动物实验、护理体会、会议记录等文献；（3）无具体用药说明或用药不完整的文献；（4）对于使用同一处方的文献，取发表时间在前的1篇；（5）治疗总有效率低于90%的文献。

1.3数据规范化处理根据《全国中草药汇编》（第3版）[4]和全国高等中医药院校“十三五”规划教材《中药学》[5]对中药名称进行统一，如将“银花藤”规范为“忍冬藤”。炮制后药物功效有显著差异者则分别录入，如生地黄、熟地黄等。由研究员将规范化处理后的方药信息录入Excel 2019，建立急性软组织损伤方药数据库。

1.4数据挖掘与分析将急性软组织损伤方药数据库导入中国中医科学院中医药信息研究所研发的古今医案云平台（Version 2.3.5），对数据进行统计分析并挖掘用药规律，筛选核心药物。数据挖掘方法包括用药频次分析、性味归经分析、关联规则分析、聚类分析等。

1.5核心药物机制的网络药理学分析

1.5.1 靶点筛选 根据“1.4”项得到的分析结果，选择中药外用治疗急性软组织损伤最核心的药物输入BATMAN-TCM数据库，获取其活性成分所对应的靶点[6]。以“acute soft tissue injury”为关键词，在GeneCards数据库、OMIM数据库、Drugbank数据库中获取急性软组织损伤相关靶点。利用Venny 2.1在线平台获取核心药物-急性软组织损伤共同靶点。

1.5.2 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析 利用String平台[7]对核心药物-急性软组织损伤共同靶点进行PPI分析，并利用Cytoscape 3.7.2软件筛选潜在作用靶点。

1.5.3 功能富集分析 将潜在作用靶点导入DAVID 6.8数据库[8]进行基因本体（gene oncology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1常用中药频次分析按照筛选标准，最终纳入478篇文献，478首中药处方，涉及中药350味，用药总频次为4 753次。用药频次≥70次的高频药物共计16味，其频次与频率（频次/4 753×100%）分布结果见表1。

表1 中药外用治疗急性软组织损伤处方中用药频次≥70次的中药Table 1 Herbs with the medication frequency being or over 70 times in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.2药物性味归经分析350味中药的属性中，四气以温性药的使用频次最高，达1 897次（占比39.91%），其次为寒性药、平性药等；五味以辛味药的使用频次最高，达2 758次（占比58.03%），其次为苦味药、辛味药等；归经以归足厥阴肝经的药物使用频次最高，达3 073次（占比64.65%），其次为归足太阴脾经、手少阴心经、手太阴肺经等。药物的性味归经分析结果见图1。

图1 中药外用治疗急性软组织损伤处方中药物的性味归经分析雷达图Figure 1 Radar map of the properties，flavors and meridian tropism of the herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.3关联规则分析对中药外用治疗急性软组织损伤的高频药物（频次≥70次）进行关联规则分析，设置支持度（体现药物组合在所有处方中出现的频次）≥10%，置信度（体现药物组合之间的关联性）≥70%[9]，共获得13条核心关联规则，结果见表2。所有药物组合的提升度都大于1，说明这些药物组合结果差异在统计学上均有意义[10]，且支持度与置信度均最高的药物组合为乳香-没药，提示这一药对是中药外用治疗急性软组织损伤的核心药物组合。

表2 中药外用治疗急性软组织损伤核心药物关联规则（支持度≥10%，置信度≥70%）Table 2 Association rule analysis of the core herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury（support≥10%，confidence≥70%）

2.4聚类分析选用欧氏距离，利用最长距离法对中药外用治疗急性软组织损伤的高频药物（频次≥70次）进行系统聚类分析[11]，结果见图2。以欧氏距离≥16为分界，可将高频药物分为3个有效聚类群。聚类1药物包括栀子、大黄、黄柏；聚类2药物包括乳香、没药、红花、当归；聚类3药物包括冰片、血竭、白芷、川乌、草乌、三七、延胡索、川芎、赤芍。

图2 中药外用治疗急性软组织损伤的高频药物聚类图Figure 2 Clustering analysis of the high-frequency herbs in the Chinese medicine prescriptions for external use in treating acute soft tissue injury

2.6核心药物的网络药理学分析

2.6.1 核心药物活性成分及靶点的筛选结果 通过BATMAN-TCM数据库获得核心药物乳香-没药的活性成分及其所对应的潜在作用靶点，其中乳香共计18个活性成分，对应1 085个靶点；没药共计11个活性成分，对应578个靶点。二者取并集再去重，最终共获得28个活性成分、698个潜在作用靶点。通过GeneCards、OMIM、Drugbank数据库获得急性软组织损伤相关靶点共601个，利用Venny 2.1在线平台筛选得到取核心药物-急性软组织损伤的共同靶点105个，绘制韦恩（Venn）图，结果见图3。

图3 核心药物-急性软组织损伤（ASTI）共同靶点的韦恩（Venn）图Figure 3 Venn diagram of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by core drugs

将核心药物筛选后得到的28个活性成分与预测的105个治疗急性软组织损伤共同靶点输入Cytoscape 3.7.2软件，绘制核心药物-活性成分-急性软组织损伤的潜在靶点网络图，结果见图4。在该网络中，共有135个节点，327条边。菱形节点表示药物，椭圆形节点表示活性成分，矩形节点表示治疗急性软组织损伤潜在靶点，每条边代表活性成分与靶点之间的作用关系。

图4 核心药物-活性成分-急性软组织损伤的潜在靶点网络图Figure 4 Potential target network of core drugs-active ingredient for the treatment of acute soft tissue injury

2.6.2 PPI网络构建及分析结果 将乳香-没药治疗急性软组织损伤的105个潜在作用靶点导入String平台，得到蛋白互作网络图，结果见图5。图5结果显示，该蛋白互作网络共有105个节点，1 325条边。图中节点颜色越深、对应靶点度值越大，表明关键性越高。利用“CytoNCA”进行网络分析其各节点度值，得到其度值中位数为20，取其二倍值，筛选出关键靶点23个，结果见表3。筛选结果提示，这23个靶点很可能是核心药物乳香-没药发挥药理作用的潜在关键靶点。

表3 核心药对乳香-没药治疗急性软组织损伤的关键靶点信息Table 3 Key target information of the core herbal pair of Olibanum-Myrrha in the treatment of acute soft tissue injury

图5 核心药对乳香-没药治疗急性软组织损伤的靶点蛋白互作网络图Figure 5 Protein-protein interaction network of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

2.6.3 GO功能富集分析结果 利用DAVID 6.8数据库对乳香-没药治疗急性软组织损伤的105个潜在作用靶点进行GO功能富集分析，共得到562条相关通路（P＜0.05）。其中生物过程（biological process，BP）通 路461条，细 胞 组 分（cellular component，CC）通路41条，分子功能（molecular function，MF）通路60条。以P值排序，分别选取排前20位的GO条目用于绘制GO二级分类图，结果见图6。BP通路主要富集在信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、DNA模板转录的正向调节等；CC通路主要富集在细胞质、质膜、细胞外间隙、细胞外泌体等；MF通路主要富集在相同蛋白质结合、蛋白质同源二聚体活性、酶结合等。

图6 核心药对乳香-没药治疗急性软组织损伤的潜在作用靶点的GO功能富集分析结果Figure 6 Gene oncology（GO）pathway enrichment analysis of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

2.6.4 KEGG通路富集分析结果 应用DAVID 6.8数据库对乳香-没药治疗急性软组织损伤的105个潜在作用靶点进行KEGG富集分析，共得到83条相关通路（P＜0.05）。以P值排序，取其前20条通路，用R软件绘制气泡图，结果见图7。纵坐标为KEGG通路名称，横坐标为各通路所占基因比值，气泡大小为各通路所包含的基因数目，气泡越大，表明富集在该条KEGG通路上的基因越多。图7结果显示，乳香-没药治疗急性软组织损伤的主要通路有PI3K-Akt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等。结果提示，乳香-没药有效活性成分可能通过调控这些信号通路发挥对急性软组织损伤的治疗作用。

图7 核心药对乳香-没药治疗急性软组织损伤潜在靶点KEGG通路富集分析Figure 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analysis of the potential targets for the treatment of acute soft tissue injury by the core herbal pair of Olibanum-Myrrha

3 讨论

急性软组织损伤属于中医学的“筋伤”范畴。人体受到损伤后，气机不畅，则气血运行受阻，滞于筋脉之中，发为肿痛。人体损伤后可致血凝脉中，血液运行受阻，不通则痛；瘀血阻塞脉络可致血溢脉外，脉外之血聚集于局部组织则可见皮肤红肿青紫。故中医学认为，急性软组织损伤的病因病机为气血失和，气滞血瘀，阻滞筋脉，筋脉不通则痛，最终发为本病。

本研究中的用药频数分析结果显示，中药外用治疗急性软组织损伤的常用药物有大黄、红花、乳香、没药、当归、黄柏、栀子、冰片、白芷、血竭、川乌、三七、川芎、草乌、赤芍、延胡索等。其中使用频次排位居首的大黄，具有“止血不留瘀”的特点。现代药理学研究[12]结果表明，大黄中的蒽醌类、黄酮类活性物质可抗血小板聚集，抑制血栓素α2的形成，从而升高血浆渗透压，降低血液黏稠度，最终改善微循环和血液流变性。红花具有活血通经、散瘀止痛等功效，使用频次排位居第二。吴泊等[13]的研究发现，红花中的红花黄色素和红花醌苷能有效缩短血栓长度，延长凝血酶时间及凝血酶原时间，提升纤溶活性，产生抗凝、抗血栓形成的作用。

从药物性味归经来看，性温、味辛苦、归肝脾心经的药物最多。温性药可活络通筋；辛味药能散能行，行气活血。清代钱秀昌的《伤科补要》曰：“跌打损伤之证，恶血留内，则不分何经，皆以肝为主。盖肝主血也，败血必归于肝。其痛多在胁肋小腹者，皆肝经之道路也”。故肝经气血通畅则其他经络也能瘀去新生，气行络通。中药外用治疗多选用性温、味辛苦、归肝脾心经的药物，这与急性软组织损伤患者气滞血瘀阻滞于筋脉之中，导致筋脉不通则痛的病机是相契合的。

关联规则分析结果显示，支持度最高、置信度最高的药物组合都是乳香-没药。两者味皆辛苦，皆归心肝脾经，临床上常以药对的形式相须为用，具有良好的行气散瘀、活血止痛的效果。明代李时珍在《本草纲目》中记载：“乳香活血，没药散血，皆能止痛、消肿、生肌，故二药每每相兼而用。”此外，清末民国初年的张锡纯在其《医学衷中参西录》也曾记载：“乳香、没药，二药并用，为宣通脏腑、流通经络之要药，故凡心胃胁腹肢体关节诸疼痛皆能治之……外用为粉以敷疮疡，能解毒、消肿、生肌、止痛，虽然开通之品，不耗伤气血，诚良药也。”蒋海峰等[14]的研究发现，乳香与没药合用对抑制血小板聚集、抗凝血酶活性均能产生显著效应，呈现协同增效作用。

聚类分析结果显示，取群集数16可得到3个有效聚类群。聚类1药物（栀子、大黄、黄柏）中的大黄具有清热泻火、凉血解毒、止血、逐瘀通经的功效，复元活血汤中就重用大黄以涤荡留瘀败血，引瘀血下行。大黄与栀子、黄柏二药配伍使用可增强活血化瘀之效。聚类2药物（乳香、没药、红花、当归）以活血药为主，其中当归既善补血，又能活血。清代医家张山雷在《本草正义》中称当归“诚血中之气药，亦血中之圣药也”。当归与活血药物乳香、没药、红花配伍，既能增强活血祛瘀、通络止痛之功效，又能够活血补血，化瘀而不伤正。聚类3药物（冰片、血竭、白芷、川乌、草乌、三七、延胡索、川芎、赤芍）为活血药、祛风湿药、清热药、解表药的综合应用。现代药理学研究[15]证实，白芷中的总香豆素和挥发油组合物具有良好的抗炎镇痛作用。川芎被誉为“血中之气药”，延胡索可活血、行气、止痛，二者皆能活血化瘀，行气导滞，适用于急性软组织损伤的治疗。

通过用药频数分析、关联规则分析、聚类分析，得到乳香-没药这一核心药对，以此药对为研究对象，运用网络药理学方法研究其治疗急性软组织损伤的作用机制。网络药理学研究表明，乳香-没药治疗急性软组织损伤的关键靶点主要为白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1β、肿瘤蛋白53（TP53）等，主要涉及信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、DNA模板转录的正向调节、细胞增殖的正调控等生物过程。KEGG信号通路富集分析结果显示，乳香-没药治疗急性软组织损伤主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路等。PI3K-Akt信号通路在抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管生成等方面发挥着重要的生物学功能[16]。研究[17-18]发现，PI3K-Akt信号通路在骨骼肌损伤时被激活，从而能抑制肌原纤维蛋白的降解和肌萎缩基因的表达，促进骨骼肌增殖和增加总肌管数量。MAPK信号通路与炎症、细胞生长和分化相关，当肌肉组织受到急性剧烈伤害时，可增加活性氧（ROS）的产生从而上调MAPK信号家族中ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化水平，最终导致肌肉等软组织产生炎症反应[19-20]。NF-κB信号通路被认为是调节炎症反应的关键通路。研究[21]发现，这一通路中的上游因子TAK1蛋白和下游因子P65蛋白能抑制炎症反应，改善局部软组织炎症。故乳香-没药治疗急性软组织损伤可能与调节细胞增殖、基因表达及炎症反应等相关。

综上，本研究通过对文献数据挖掘，依托古今医案云平台总结了中医外用治疗急性软组织损伤的用药规律，并结合网络药理学分析了核心药物乳香-没药药理作用的潜在机制，可为临床中药外用治疗急性软组织损伤提供参考，亦可为中药的疗效机制研究提供思路。