稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落与水稻产量的关联分析

宋 宇

（辽东学院，辽宁 丹东 118003）

长期以来大量施用化肥和农药提高了农作物的产量，同时也造成了一系列的生态环境污染，危害农业的可持续化发展。截至目前，已通过在稻田中配施生物有机肥、微生物菌剂等起到了预防土传病害、增加土壤肥力、净化和修复土壤、减少化肥使用，并提高水稻产量和稻米安全的作用[1-5]。近些年来，将动物引进稻田的共作模式也受到人们的广泛关注。该模式不仅能改善土壤环境、提高养分循环效率，还能提高水稻的产量[6-7]。

根际土存在于植物根系周围，对根系生长影响巨大[8]。根际土壤微生物是根际微生态的重要组成部分，其对环境变化非常敏感，且在根际土壤有机质分解、土壤养分转化、病害防治和增强植物免疫力等方面发挥着重要作用[9-11]。在根际土壤微生物群落结构研究方面，分析手段有了实质性进展，已由具有一定局限性的DGGE（变性梯度凝胶电泳）、PLFA（磷脂脂肪酸）法、CLPPs（微生物群落水平生理图谱）[12-13]等技术发展到能全面分析微生物群落分类、系统发育和功能多样性的高通量测序技术[14-16]。目前，关于稻田中引入鱼、鸭、龙虾等进行共作种养模式的研究多集中在对微生物群落结构、多样性的影响及不同品种、不同播种期对水稻产量和品质的影响[7，17-18]上，而对共作稻田中根际土壤微生物群落结构、功能及其与水稻生长和产量相关性研究方面还未见报道。鉴于此，拟基于NOVAseq平台的宏基因组测序分析施入生物有机肥的稻蟹共作稻田中根际土壤微生物群落结构、功能、多样性及其与水稻生长和产量的相关性，以探讨稻蟹共作稻田水稻促生机制，为稻田共作水稻栽培提供参考。

1 材料和方法

1.1 大田试验设计

供试水稻品种为越光大米，试验地点设在丹东市东港市北井子镇盖家坝有机种植农场。试验设2个处理：仅施生物有机肥（YJTCS，对照）、稻蟹共作（HXTCS）。YJTCS、HXTCS 处理中的生物有机肥相同，购自日照益康有机农业科技发展有限公司（有机质＞50%，生物活菌数＞2 亿个/g）。YJTCS、HXTCS处理均分别于2020 年3 月和7 月施入生物有机肥1.35 kg/hm2，其中HXTCS 处理于4 月末按0.5 kg/hm2投放河蟹苗，10月末收蟹。其他管理措施同当地常规操作。

1.2 样品采集

在水稻成熟期，根据5 点采样法采集水稻植株根际土壤，混匀后放入收集袋，置于盛有冰袋的收集盒中，迅速送至实验室，液氮冷冻后放入-80 ℃冰箱保存。样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA 提取和宏基因组测序。每个处理各设3 次生物学重复。同时，测量水稻根长、株高和穗长，统计单穗粒数和千粒质量。

1.3 土壤DNA提取、宏基因组测序及分析

利用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美国）进行DNA 抽提，测定DNA 浓度。量取2µg DNA样品送上海美吉生物医药科技有限公司，采用Illumina NovaSeq 高通量测序平台进行宏基因组测序。使用fastp[19]对read 3′端和5′端的adapter 序列进行质量剪切；使用基于succinct de Bruijn graphs的拼接软件MEGAHIT[20]对优化序列进行拼接组装，筛选≥300 bp 的contig 作为最终的组装结果；使用MetaGene[12]对contig 进行ORF 预测。选择核酸长度≥100 bp 的基因，将其翻译为氨基酸序列；用CDHIT[13]对预测出来的基因序列进行聚类，每类取最长的基因作为代表序列，构建非冗余基因集；使用SOAPaligner[14]软件，分别将每个样品的高质量read与非冗余基因集进行比对，统计基因在对应样品中的丰度信息；使用Diamond 将非冗余基因集的氨基酸序列与NR 数据库进行比对[21]，并通过NR 数据库对应的分类学信息数据库获得物种注释，然后使用物种对应的基因丰度总和计算该物种的丰度。

2 结果与分析

2.1 河蟹对稻田水稻生长和产量的影响

以根长、株高、穗长、单穗粒数和千粒质量作为水稻生长和产量指标来衡量水稻的生长和产量。如表1 所示，稻蟹共作（HXTCS）稻田的根长高于对照但差异不显著；株高、穗长显著低于对照（YJTCS）（P＜0.05）；单穗粒数和千粒质量则显著高于YJTCS（P＜0.05），分别提高了81.3%、11.39%。表明河蟹利于提高生物有机肥稻田的水稻产量。

表1 2种稻田水稻的生长和产量指标Tab.1 Growth and yield indexes of rice of two paddy fields

2.2 河蟹对稻田根际土壤微生物群落组成的影响

利用Illumina NovaSeq 测序平台对2 种稻田根际土壤样品进行了宏基因组测序，共获得1 594 699个非冗余基因用于生物信息学分析。结果（图1）显示，2 种样品的优势物种为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、隶属于芽单胞菌门的一种细菌（Gemmatimonadetes_d_Bacteria）、广古菌门（Euryarchaeota）、未分类的一种细菌 Unclassified_d_Bacteria、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。河蟹引入生物有机肥稻田后，在水稻的成熟期变形菌门、放线菌门和广古菌门的相对丰度分别下降了5.71%、16.12%、51.01%，绿弯菌门、酸杆菌门、疣微菌门的相对丰度则分别增加了23.35%、41.36%、50.00%。

图1 2种稻田根际土壤微生物门水平群落组成Fig.1 Composition of microbial community at the phyla level in rhizosphere soil of two paddy fields

2.3 河蟹对稻田根际土壤微生物α多样性的影响

2 种稻田根际土壤微生物α 多样性分析结果如表2 显示，HXTCS 根际土壤中的微生物α 多样性均低于YJTCS，Chao 指数、Ace 指数、Shannon 指数、OTU数分别较YJTCS降低了11.22%、7.54%、2.00%、15.60%。其中，Ace指数和OTU数在YJTCS、HXTCS中差异达到了显著水平（P＜0.05）。这可能和河蟹引入稻田后降低了变形菌门、放线菌门和广古菌门的相对丰度有关。

表2 2种稻田根际土壤微生物α多样性Tab.2 α diversity of microbes in rhizosphere soil of two paddy fields

2.4 河蟹对稻田根际土壤微生物β多样性的影响

β多样性分析可通过对不同微生物群落间的物种多样性进行比较，明确不同样本间群落组成的相似性或差异性。常用的β多样性分析方法有样本层级聚类分析、PCA（主成分分析）、PCoA（主坐标分析）等。其中，PCA 可根据样本间距离的远近来判断样本结构的差异性或相似性。HXTCS 与YJTCS根际土壤中微生物群落结构PCA 结果如图2 所示，二者微生物群落是明显分开的，表明2 种稻田土壤微生物群落结构差异较大。

图2 2种稻田根际土壤微生物群落结构PCA分析Fig.2 PCA analysis of microbial community structure in rhizosphere soil of two paddy fields

2.5 水稻生长和产量指标与微生物群落组成和多样性的相关性分析

水稻生长和产量指标与微生物群落组成和多样性的Spearman 相关性分析结果见表3。由表3 可知，株高和穗长与绿弯菌门均呈显著负相关（P＜0.05），相关系数分别为-0.885 71、-0.828 57。单穗粒数与放线菌门呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数为-0.942 86；单穗粒数与酸杆菌门、Gemmatimonadetes_d__Bacteria、拟杆菌门均呈显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为0.828 57、0.828 57、0.885 71；单穗粒数与疣微菌门呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数达到0.942 86。千粒质量与广古菌门呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.828 57。单穗粒数与Ace 指数呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.885 71；单穗粒数与Chao 指数和Shannon指数均呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数均为-0.942 86。说明河蟹引入稻田后富集的相关物种在促进水稻生长发育过程中发挥了重要作用。

表3 水稻生长和产量指标与微生物群落组成和多样性的相关性Tab.3 Correlation of rice growth and yield indexes with microbial community composition and diversity

续表3 水稻生长和产量指标与微生物群落组成和多样性的相关性Tab.3（Continued） Correlation of rice growth and yield indexes with microbial community composition and diversity

2.6 水稻生长和产量指标与COG功能注释的相关性分析

利用宏基因组测序，通过比对EggNOG（Evolutionary genealogy of genes：Non-supervised orthologous groups，基因进化谱系：非监督直系同源群）数据库可获得基因对应的COG（Cluster of orthologous groups of proteins，蛋白质相邻类的聚簇）功能注释共计273 20 个，分属于细胞过程及信号、信息存储和处理、代谢以及未知的功能等四大功能。其中，代谢是主要的COG 功能注释，分类水平总丰度前20 位的代谢功能与水稻生长和产量指标进行Spearman 相关性分析结果见表4。由表4 可知，根长与催化醋酸盐转化为乙酰辅酶A 呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.869 66。株高与烯酰辅酶A 水合酶呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.828 57；株高与磷酸转移酶呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.942 86。穗长与P-型ATP 酶呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.885 71。Amp依赖性合成酶和连接酶与根长、株高和穗长均呈正相关但相关性不显著，相关系数分别为0.376 85、0.714 29、0.657 14；Amp 依赖性合成酶和连接酶与单穗粒数和千粒质量均呈负相关，相关系数分别为-0.942 86、-0.542 86，其中与单穗粒数呈极显著负相关（P＜0.01）。醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶与单穗粒数和千粒质量均呈正相关，相关系数分别为0.942 86、0.714 29，其中与单穗粒数呈极显著正相关（P＜0.01）。乙酰乳酸合酶、磷酸转移酶与单穗粒数均呈显著负相关（P＜0.05），相关系数均为-0.828 57。糖基转移酶与千粒质量呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数是-0.942 86。说明相关酶在水稻的生长发育过程中起到一定的作用。

表4 水稻生长和产量指标与COG功能注释的相关性Tab.4 Correlation of rice growth and yield indexes with COG function annotation

续表4 水稻生长和产量指标与COG功能注释的相关性Tab.4（Continued） Correlation of rice growth and yield indexes with COG function annotation

2.7 水稻生长和产量指标与主要KEGG代谢通路的相关性分析

宏基因组测序结果显示，共有159 469 9个非冗余基因注释到KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因及基因组百科全书）的代谢通路中，共有421类代谢通路，主要代谢功能与水稻生长和产量指标的Spearman 相关性分析结果见表5。由表5可知，根长与氨酰-tRNA 生物合成呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.811 68。株高与群体感应在0.001 水平上呈负相关（P＜0.001），相关系数为-1.000 00。穗长与次级代谢产物的生物合成、双组分系统和丁酸酯代谢均呈显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为0.885 71、0.885 71、0.828 57；穗长与碳代谢和氧化磷酸化均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数均为0.942 86；穗长与糖酵解/糖异生在0.001 水平上呈正相关（P＜0.001），相关系数达到1.000 00；穗长与氨酰-tRNA 生物合成呈显著负相关（P＜0.05），相关系数为-0.828 57。单穗粒数与氨基酸的生物合成、原核微生物的碳固定和甲烷代谢均呈显著负相关（P＜0.05），相关系数分别为-0.828 57、-0.885 71、-0.828 57；单穗粒数与丙酮酸代谢呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数为-0.942 86。千粒质量与群体感应、氨酰-tRNA 生物合成均呈显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为0.828 57、0.885 71；千粒质量与乙醛酸和二羧酸的代谢呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.942 86；千粒质量与糖酵解/糖异生和甲烷代谢均呈显著负相关（P＜0.05），相关系数分别为-0.885 71、-0.771 43。说明代谢通路在促进水稻产量提升方面发挥着重要作用。

表5 水稻生长和产量指标与主要KEGG代谢通路的相关性Tab.5 Correlation of rice growth and yield indexes with main KEGG metabolic pathway

2.8 水稻生长和产量指标与碳水化合物活性酶相关性分析

CAZy（Carbohydrate-active enzymes database）是碳水化合物活性酶专业数据库，其包括能催化碳水化合物降解、修饰，以及生物合成的相关酶系家族。包含5 个主要分类：糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）、糖基转移酶（Glycosyltransferase）、多糖裂解酶（Polysaccharide lyase）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate esterase）和氧化还原酶（Auxiliary activity）。此外，还包含与碳水化合物结合结构域（Carbohydrate-binding module）。水稻生长和产量指标与碳水化合物活性酶的Spearman 相关性分析结果见表6。由表6 可知，株高与与碳水化合物结合结构域呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数为0.942 86；单穗粒数与糖基转移酶呈显著正相关（P＜0.05），相关系数为0.885 71；千粒质量与与碳水化合物结合结构域呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数为-0.942 86。

表6 水稻生长和产量指标与碳水化合物活性酶的相关性Tab.6 Correlation of rice growth and yield indexes with carbohydrate-active enzymes

3 结论与讨论

3.1 稻蟹共作稻田根际土壤微生物群落结构与水稻生长和产量的关系

水稻可以通过特异根际微生物提高对有机氮源的利用效率，进而促进水稻生长[22]。本研究宏基因组测序结果表明，河蟹引入生物有机肥稻田后绿弯菌门、酸杆菌门和疣微菌门相对丰度提升，变形菌门、放线菌门和广古菌门的相对丰度下降，进而造成根际土壤微生物α多样性下降和较大的群落结构差异。有研究认为，绿弯菌门可参与硝化作用中亚硝酸根离子的氧化，促进农作物对氮素营养的吸收和产量的提升[23]。酸杆菌门具有光合能力，同时具有可参与铁循环和单碳化合物代谢及降解植物残体的功能[24]。ZHAO 等[25]的研究认为，水体中的疣微菌门与碳源利用呈正相关。本研究中，水稻生长和产量指标与微生物群落组成的相关性结果显示，绿弯菌门与单穗粒数和千粒质量均呈正相关，与株高和穗长均呈显著负相关，说明根际土壤富集绿弯菌门有助于水稻产量的提升，这与FAN 等[26]的研究结果一致。单穗粒数与酸杆菌门和疣微菌门呈显著或极显著正相关，而与α 多样性指数（Chao指数、Ace 指数和Shannon 指数）呈显著或极显著负相关（P＜0.05），推测稻蟹共作稻田的水稻产量提升可能和绿弯菌门、酸杆菌门和疣微菌门相对丰度提升有关，但需进一步研究证实。

3.2 稻蟹共作稻田根际土壤微生物COG功能注释与水稻生长和产量的关系

Amp 依赖性合成酶和连接酶是维持木质素和类黄酮等植物苯丙素类生物合成代谢的一系列重要酶类，是植物正常生长的必需酶类[27]。P-型ATP酶是一类广泛存在于生物体内并可通过ATP 降解驱动的阳离子泵[28]。醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶都属于钼酶。醛氧化酶可氧化醛类物质和将含氮杂环物质羟基化，在机体代谢过程中起重要作用。黄嘌呤脱氢酶广泛分布在细菌、真核生物和古细菌中，可催化黄嘌呤和次黄嘌呤生成酰脲类物质，且与氮同化、激素代谢等过程相关[29]。水稻生长和产量指标与COG 功能注释的相关性分析结果显示，Amp依赖性合成酶和连接酶与根长、株高和穗长均呈正相关但与单穗粒数呈极显著负相关，说明该酶促进水稻生长但不利于产量提升。P-型ATP 酶与穗长呈显著正相关，与单穗粒数和千粒质量均呈负相关，说明P-型ATP酶同样能促进水稻生长，但不利于产量提升。醛氧化酶和黄嘌呤脱氢酶均与单穗粒数和千粒质量呈正相关，且与单穗粒数呈极显著正相关，说明2 种酶均有助于水稻产量增加。磷酸转移酶与株高呈极显著正相关而与单穗粒数呈显著负相关，表明该酶对水稻生长有利。

3.3 稻蟹共作稻田根际土壤微生物的KEGG代谢通路与水稻生长和产量的关系

氨酰-tRNA 具有将氨基酸运转到核糖体合成蛋白质的功能。广泛存在于革兰氏阴阳性细菌中的群体感应系统是细菌种内、种间及细菌与宿主间信息交流的重要途径，可调控细菌许多重要的生理功能[30]。有研究认为，微生物在胁迫条件下乙醛酸和二羧酸的代谢产物会增加[31]；碳代谢和氧化磷酸化代谢是淹水条件下稻田土壤微生物的主要代谢过程，可在代谢过程中产生能量[32]；糖酵解是微生物最古老的一种在有氧和无氧条件下都能进行的获能方式。本研究中，水稻的生长和产量指标与主要KEGG代谢通路的相关性分析结果显示，氨酰-tRNA生物合成与根长和千粒质量均呈显著正相关，与穗长呈显著负相关，表明氨酰-tRNA 生物合成利于根长和千粒质量的增加，但不利于穗长增加。群体感应与株高在0.001 水平上呈负相关，与千粒质量呈显著正相关，表明群体感应不利于株高增加，而利于千粒质量增加，有助于提升水稻产量。乙醛酸和二羧酸的代谢与千粒质量呈极显著正相关，表明其代谢产物有助于水稻产量提升。碳代谢、氧化磷酸化和糖酵解均与穗长呈正相关而与单穗粒数和千粒质量呈负相关，表明能量代谢虽能提高穗长，但不利于产量提升。

3.4 稻蟹共作稻田根际土壤微生物的碳水化合物活性酶与水稻生长和产量的关系

与碳水化合物结合结构域可将酶连接到聚合物表面并增加基质的局部浓度，从而导致更有效的催化作用[33]。糖基转移酶催化生物体内糖的活化，使它们能够与不同的受体分子（如蛋白质、核酸和低聚糖）连接，因此，糖基转移酶可以表现出与任何酶类的底物和产物相关的最大化学多样性[34]。本研究中，水稻的生长和产量指标与碳水化合物活性酶相关性分析结果表明，与碳水化合物结合结构域与株高呈极显著正相关，与千粒质量呈极显著负相关，表明该结构域有利于株高提升，但不利于千粒质量提升。单穗粒数与糖基转移酶呈显著正相关，表明该酶有利于单穗粒数提升，从而可能有助于产量增加。

综上，河蟹引入生物有机肥稻田后没有促进株高和穗长的增长，但显著提升了水稻的单穗粒数和千粒质量，进而有助于提高产量。宏基因组测序技术分析结果表明，水稻生长和产量指标的变化与根际土壤微生物群落结构和功能的变化都有一定相关性。