不同面团强度小麦品种差异表达贮藏蛋白基因分析

晁岳恩，李文旭，王沙沙，杨 攀，吴政卿

（1. 河南省农业科学院 小麦研究所/河南省小麦生物学重点实验室，河南 郑州 450002；2. 河南省农业科学院 分子育种研究院，河南 郑州 450002）

小麦籽粒贮藏蛋白主要包括醇溶蛋白、麦谷蛋白、球蛋白、清蛋白以及近年来发现的类燕麦贮藏蛋白等。小麦面粉的独特性在于其贮藏蛋白中的面筋蛋白质（主要是醇溶蛋白和麦谷蛋白）与水相互作用能交联成高分子的、疏松多孔的网状胶状物质面筋，面筋蛋白质的类型和含量影响着面团的强度、黏弹性、延展性等指标。其中，麦谷蛋白主要影响面团的强度和弹性，醇溶蛋白主要影响面团的黏性和延展性，这两类蛋白质是影响面团性状的主要因素[1-3]。通常认为，小麦成熟籽粒中，蛋白质含量占总干质量的8%～20%[4]。其中，面筋蛋白质占小麦总蛋白质的80%～85%[5]。

小麦的加工品质与籽粒中贮藏蛋白的总含量直接相关。一般情况下，总蛋白质含量增加，面筋蛋白质含量也相应增加，并导致面团强度增强、面包体积增大。但实际生产中也存在蛋白质含量较低但面团强度较高的小麦品种，表明面粉质量形成原因比较复杂，不仅受籽粒贮藏蛋白质含量影响，还受蛋白质成分等因素影响[6]。面筋蛋白质的主要成分是麦谷蛋白和醇溶蛋白，其中，麦谷蛋白按分子质量大小又可分成高分子质量麦谷蛋白亚基（High molecular weight glutenin subunits，HMWGS）、低分子质量麦谷蛋白亚基（Low molecular weight glutenin subunits，LMW-GS）两类。通常认为，HMW-GS 约占小麦贮藏蛋白的10%，可通过分子间或分子内二硫键作用形成面筋骨架，决定着面团的强度和弹性[5-7]。ZHANG 等[8]研究发现，HMW-GS 对面团强度有正向效应；CHEN 等[9]研究发现，1Bx7或1By9基因缺失导致面团强度变弱；ALTPETER 等[10]通过转基因方法证明了超表达1Dy10亚基基因可增加面筋蛋白质含量，特别是将1Dx5和1Dy10两个亚基基因同时表达时，面筋蛋白质含量可提高至原来的3 倍以上[10]。另外，HMW-GS 之间的组合方式被认为决定着小麦70%的优良加工品质性状[11-12]。然而，在育种过程中却发现，即使HMW-GS 组合完全一致，小麦品种之间的面粉质量也存在较大差异，暗示HMW-GS 组合可能只是影响面粉质量的因素之一。为明确可能存在的其他影响面粉品质的蛋白质，以具有一定亲缘关系且HMW-GS组合完全一致而面团强度不同的2 个小麦品种为试验材料，在籽粒贮藏蛋白积累速度较稳定的灌浆中期（前期蛋白质表达量较低，而后期表达的蛋白质多为种子防御和抗逆相关的蛋白质）[13-16]，对籽粒进行转录组测序分析，比较贮藏蛋白基因的表达差异，探讨HMW-GS 组合相同情况下面粉质量差异的可能原因。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为郑麦119 和郑麦158，2 个品种由郑麦366 与不同品种杂交后选育而成。其中，郑麦119 亲本组合为济麦1 号×郑麦366，郑麦158 亲本组合为[（Bigeaz-250/96）×周麦16]×郑麦366。试验于2019—2020 年在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地（新乡市原阳县，113°42′4″E、35°0′17″N）进行。成熟期，收获成熟籽粒，用BUHLER实验磨磨粉，测定相关指标。

1.2 转录组测序及生物信息学分析

分别于开花后14、21、28 d 取小麦穗中部两侧籽粒进行转录组测序分析。RNA 提取、转录组测序基因组比对、转录本组装、FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）定 量 及 GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析工作均由杭州联川生物技术有限公司完成。每个样品3次生物学重复，基因表达量差异倍数＞2 倍且达到0.05显著水平定义为差异表达基因。

1.3 面粉品质参数分析

用瑞典Perten 公司的2200 型面筋仪（Glutomatic）按GB/T 14608—93 测定小麦粉湿面筋含量、面筋指数；用德国Brabender 公司的810104 型粉质仪（Farinograph）按GB/T 14614—93 测定面团形成时间、稳定时间等。

1.4 面粉蛋白质提取和SDS-PAGE电泳

面粉醇溶蛋白和麦谷蛋白按照文献[17]优化的方法进行提取，然后进行SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，12%分离胶、4%浓缩胶）电泳。采用考马斯亮蓝（R-250）染色。

1.5 硫及巯基含量测定

硫含量检测：称量10 mg 面粉，加入200 µL 浓硝酸在95 ℃下消化30 min，然后在115 ℃下消化90 min，冷却至室温后用超纯水定容至1 mL。采用液相离子色谱（IC-2001，TOSOH，Japan）测定硫元素含量，阴离子标准液来自Wako Pure Chemicals（Japan），详细操作参照文献[18]。自由巯基、总巯基含量测定及二硫键含量计算参考WANG 等[19]的方法。

1.6 半胱氨酸和自由巯基含量预测

利用DiANNA1.1 Web 服务器（http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/）在线预测差异表达基因编码蛋白质的半胱氨酸和自由巯基含量。

2 结果与分析

2.1 2个小麦品种的面粉质量参数分析

从2 个小麦品种的面粉质量参数（表1）可以看出，郑麦158 的粗蛋白含量、湿面筋含量分别显著、极显著低于郑麦119，而形成时间、面筋指数、面团稳定时间均显著或极显著高于郑麦119，其中面筋指数、面团稳定时间是面团强度代表性参数，表明郑麦158籽粒中含有对面团强度贡献较大的贮藏蛋白类型；而郑麦119的粗蛋白含量虽高，但对应的面团强度参数面筋指数、面团稳定时间较低，表明其籽粒蛋白质中含有较多的劣质蛋白质类型。

表1 2个小麦品种的面粉质量参数Tab.1 Flour quality parameters of two wheat cultivars

2.2 2个小麦品种的面筋蛋白质电泳分析

从等量面粉蛋白质中抽提出麦谷蛋白、醇溶蛋白，等量体积点样后的电泳结果见图1。从1 图可以看出，2 个小麦品种的HMW-GS 组合完全一致，说明HMW-GS 组合不是导致这2 个品种面粉质量差异的主要原因；在LMW-GS 条带组成方面，郑麦158 与郑麦119 条带亮度和位置略有差异；对于醇溶蛋白，郑麦158 条带类型较少且部分蛋白质的表达丰度也稍低。

图1 2个小麦品种的麦谷蛋白和醇溶蛋白电泳分析Fig.1 SDS-PAGE of glutenin and gliadin from two wheat cultivars

2.3 2个小麦品种差异表达贮藏蛋白基因分析

根据测序结果，在开花后14、21、28 d，2 个小麦品种籽粒中HMW-GS基因表达量均无显著差异，这与蛋白质电泳结果相似，从基因表达方面证明了HMW-GS仅是影响面团强度的原因之一，并不是导致这2 个品种品质差异的主要原因；但LMW-GS 基因表达量也无显著差异，这与蛋白质电泳结果明显不符，推测可能是因为部分类燕麦贮藏蛋白与麦谷蛋白的溶解特性相似，提取的麦谷蛋白中含有类燕麦贮藏蛋白。相比郑麦119，郑麦158 籽粒发育的3个时间点中仅有5 个贮藏蛋白基因（3 个类燕麦贮藏蛋白基因和2 个醇溶蛋白基因）表达量显著上调（表2），暗示部分类燕麦贮藏蛋白和醇溶蛋白可能对面团强度有一定作用；共有23个贮藏蛋白基因表达量显著下调，特别是开花后28 d 时所有差异表达基因均显著下调表达。所有显著下调表达的基因中，数量最多的是醇溶蛋白基因（16 个），其次是类燕麦贮藏蛋白基因（5个）和球蛋白基因（2个），这与一般认为的醇溶蛋白对面团强度具有负向效应的观点一致[20-22]。从差异表达基因总数看，郑麦158中下调表达基因数量明显高于上调表达基因数量，这也从基因表达层面揭示了郑麦158粗蛋白含量较低的原因。

从差异表达基因的染色体分布来看（表2），A组染色体上有12 个，D 组染色体上有5 个，B 组染色体上有3 个，不明位点基因有8 个。表明A 组染色体上基因编码的贮藏蛋白对面团强度的影响最大，D组次之，B组最小。一个比较有意思的现象是，类燕麦贮藏蛋白基因主要定位于A、D 组染色体上，B 组染色体上未发现编码类燕麦贮藏蛋白的基因。据前人研究推测，普通六倍体小麦的四倍体祖先中曾发生过4AL/7BS 易位或近着丝粒倒位情况，原来应该位于7B 染色体短臂上的燕麦蛋白编码位点转移到了4A 染色体长臂上[23]，导致4A 染色体的长、短臂上都存在类燕麦贮藏蛋白基因，而B 组染色体上无类燕麦贮藏蛋白基因，这也可能是A、D、B染色体组和面团强度的相关性依次递减的一个原因。

表2 不同发育时期2个小麦品种籽粒中差异表达贮藏蛋白基因Tab.2 Differentially expressed storage protein genes in grains of two wheat cultivars at differential development stages

续表2 不同发育时期2个小麦品种籽粒中差异表达贮藏蛋白基因Tab.2（Continued） Differentially expressed storage protein genes in grains of two wheat cultivars at differential development stages

2.4 2个小麦品种面粉硫及巯基含量分析

许多研究结果都表明，面粉蛋白质中的自由巯基和二硫键对面团结构及面团稳定性有重要影响[24-26]。为分析低蛋白质含量、高面团强度品种郑麦158 的面粉蛋白质是否含有较多的自由巯基，对2个小麦品种面粉的硫和巯基含量进行了检测。结果（表3）表明，虽然郑麦158 面粉的总硫含量较低，但其自由巯基含量、总巯基含量和二硫键含量均显著或极显著高于郑麦119，表明郑麦158 贮藏蛋白中的半胱氨酸残基含量较高，且分子内二硫键比例较低。

表3 2个小麦品种面粉硫及巯基含量Tab.3 Sulfur and sulfhydryl contents in flour of two wheat cultivars

2.5 2个小麦品种籽粒中差异表达贮藏蛋白的半胱氨酸和自由巯基含量分析

为深入比较差异表达贮藏蛋白基因编码的蛋白质中自由巯基含量，对开花后14、21、28 d 郑麦158籽粒中的5个显著上调表达基因中的3个（另外2个在不同时间点下调表达）和显著下调基因中的9个贮藏蛋白基因编码的蛋白质的半胱氨酸和自由巯基含量进行预测。结果（表4）表明，郑麦158 中显著上调表达贮藏蛋白基因编码的贮藏蛋白的平均半胱氨酸残基含量、自由巯基含量均高于显著下调表达基因编码的贮藏蛋白，暗示高半胱氨酸含量、高自由巯基含量与高面团强度相关，这与表3结果一致。

表4 2个小麦品种籽粒中差异表达贮藏蛋白基因编码蛋白质的半胱氨酸和自由巯基含量Tab.4 Cysteine and free sulfhydryl contents in proteins encoded by differentially expressed storage protein genes of two wheat cultivars grains with differential dough strength traits 个

3 结论与讨论

本研究结果表明，HMW-GS 组合并不是决定面团强度的唯一因素，醇溶蛋白和类燕麦贮藏蛋白的含量、类型差异是引起2 个供试小麦品种面团强度差异的原因。醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分之一，占总贮藏蛋白的40%～50%[27]。通常认为，醇溶蛋白通过非共价键形式结合到面筋中，主要影响面团的黏性和延展性，对面团强度具有负向效应。本研究结果也表明，在高面团强度品种郑麦158中，绝大多数醇溶蛋白基因的表达量均显著下调。但是，也有一些研究认为，含有奇数半胱氨酸残基的醇溶蛋白中，至少会存在一个自由巯基能够形成分子间二硫键；而含有偶数半胱氨酸残基的醇溶蛋白中，也并非全部半胱氨酸残基都形成了分子内二硫键，未形成分子内二硫键的半胱氨酸残基也可以通过分子间二硫键与别的面粉蛋白质结合，进而影响面团强度[28-32]。本研究发现的2 个在郑麦158 中高表达的α-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白与面团强度是否相关需要在今后的研究中进一步确认。类燕麦贮藏蛋白基因是除醇溶蛋白基因外，第二大类表达量有显著差异的贮藏蛋白基因。类燕麦贮藏蛋白是近年来发现的与燕麦胚乳蛋白相似的一类富含半胱氨酸的贮藏蛋白，也被视为非典型面筋蛋白质组分（Atypical gluten components），包括a、b 2 个大类，且进一步又可分为若干小类[33-35]。目前，类燕麦贮藏蛋白与面粉品质的相关研究还不多[36-38]，但已有的研究结果均与本研究结果相似，都表明类燕麦贮藏蛋白对面粉强度有促进作用。例如：WANG 等[36]曾将中国春中的类燕麦b 贮藏蛋白基因在郑麦9023中超表达，明显提高了转基因材料的面团强度；但有意思的是，在这个类燕麦贮藏蛋白中增加1 个半胱氨酸突变后，面团强度和弹性下降，这是因为新增加的巯基与原有的一个自由巯基形成了分子内二硫键，说明相对于总巯基含量的增加，类燕麦贮藏蛋白中的高自由巯基含量是其影响面团强度的根本原因。MA 等[37-38]研究也发现，类燕麦b 贮藏蛋白具有改善面团强度的潜力。

在揉面过程中，不同面粉蛋白质分子的自由巯基相互结合成二硫键，形成的面筋骨架决定着面团的结构和特性[5，26，35，39]。小麦贮藏蛋白的自由巯基含量是决定面团流变学特性及烘焙质量的关键因素[40-41]。本研究结果表明，高面团强度的小麦品种郑麦158中，自由巯基含量、总巯基含量和二硫键含量均高于面团强度较低的郑麦119；郑麦158 高表达的类燕麦贮藏蛋白中含有较多的半胱氨酸残基和自由巯基。因此，进一步探索小麦籽粒蛋白质中的高半胱氨酸和高自由巯基含量形成原因，对于阐释小麦面粉质量形成机制、完善优质小麦育种技术具有重要意义。