MicroRNA 在杆状病毒侵染过程中的功能研究进展

张小霞，孙笑颜，杨艳青，王秋云，梁振普

（河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002）

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是由内源性基因编码的一类单链非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA），一般含18～25 个核苷酸，能够通过抑制mRNA翻译或促进mRNA降解在转录后水平上调节基因的表达，对细胞稳态起着关键调节作用[1-3]。miRNA 广泛存在于动植物、真菌以及病毒中，在进化上高度保守，具有组织和时序表达特异性等特点[4-6]。miRNA 的发现对现代分子生物学意义重大，它们参与生物体内各种调控途径，如生物的生长发育、新陈代谢、细胞分化与凋亡、免疫激活以及宿主与病原体互作等，且在许多试验中得到证实[7-9]。miRNA 最初由LEE 等[10]在研究线虫生长发育过程中发现。迄今为止，已在271 个物种中发现了48 000条成熟的miRNA，这些miRNA 的发现为复杂的基因调控网络研究提供了新的方向[11]。

病毒进入宿主后，不仅可以利用宿主细胞中的营养物质和能量完成自身生命活动[12]，还可以依靠miRNA 对宿主免疫防御机制作出反应[13]，目前已鉴定出多种病毒来源的miRNA，包括杆状病毒[14]。昆虫杆状病毒隶属于杆状病毒科，因其具宿主专一性，可被研制成对环境安全的病毒杀虫剂[15]。杆状病毒感染昆虫宿主后改变宿主体内miRNA 的表达谱，一方面，病毒利用miRNA 操纵宿主和自身基因的表达；另一方面，宿主利用miRNA 以抗病毒的作用方式改变病毒对宿主细胞的感染[16]。杆状病毒-昆虫的相互作用在农林业、基因治疗和基因工程疫苗等方面具有重要的应用价值，而miRNA 是杆状病毒中研究较少的调节性RNA，在害虫防治、益虫保护等方面具有巨大的应用潜力。因此，综述了杆状病毒感染昆虫宿主后病毒与宿主所编码的miRNA及其在杆状病毒-昆虫互作中的分子功能研究进展，以有助于理解杆状病毒的侵染机制和无脊椎动物的先天性抗病毒免疫机制，为杆状病毒杀虫剂的研发和应用提供理论依据。

1 miRNA的生物合成及作用机制

miRNA 的合成主要包括转录、细胞核内加工、输出细胞核及细胞质内加工4 个步骤。首先，在RNA 聚合酶Ⅱ的催化作用下，将编码miRNA 的基因转录成初级转录本（Primary miRNA，primiRNA）[17]；然后在细胞核中，pri-miRNA在RNaseⅢ家族Drosha 酶和辅助因子DGCR8（Microprocessor complex subunit 8）/Pasha（Partner of Drosha）蛋白的共同作用下被剪切加工成含有茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA），长度为60～70 nt[18]；紧接着被核内转运蛋白特异识别并紧密结合，在GTP 供能的作用下通过核孔复合物被转运到细胞质，进一步被Dicer 酶及其辅助因子TRBP 切割，形成18～25 个核苷酸长度的双链miRNA，随后双链被解开形成成熟的miRNA，其中一条链与AGO2（Argonaute 2）蛋白结合形成RNA 沉默诱导复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）发挥作用，另一条链通常被降解[19-20]。研究显示，有些miRNA 的初级转录本可不依赖于Drosha 酶和DGCR8/Pasha 的剪切加工直接形成miRNA 前体[21-22]，再进一步加工为miRNA 成熟体[17]。目前，科学家已经在许多物种中发现并证实了miRNA 的存在。研究发现，miRNA 参与生物新陈代谢、物质循环、细胞信号转导等生理过程和肿瘤、心脑血管疾病等病理过程以及宿主-病毒的相互作用等[8，23]。成熟miRNA的5′端第2—8位碱基被称为“种子区”，它们在不同物种中高度保守，通常能与mRNA 的3′非翻译区（UTR）结合，抑制翻译或降解mRNA，从而调节基因的表达[24-25]。也有研究发现，某些条件下miRNA 可以与基因的5′UTR、编码序列（CDS）或启动子区域结合，调节转录或激活翻译[26-27]。

2 昆虫宿主编码的miRNA及其功能

2.1 昆虫编码的miRNA

研究昆虫miRNA 的主要障碍之一是有限的昆虫全基因组序列，但自2000年黑腹果蝇的基因组测序完成后，昆虫基因组测序进入了飞速发展的阶段[28]。近年来，科学家利用新技术和新方法，鉴定了不同昆虫编码的miRNA，并分析了miRNA 在不同病毒感染下的表达水平，为研究miRNA 在昆虫发育以及昆虫-病毒互作中的功能机制奠定了理论基础[29-30]。经鉴定，感染蓝舌病病毒的白纹伊蚊细胞与正常细胞具有140 个差异表达的miRNA[31]；在感染家蚕质型多角体病毒的家蚕中肠与正常家蚕中肠中鉴定出406 个miRNA，其中58 个miRNA 表达具有显著差异，说明病毒感染之后确实改变了宿主miRNA 的表达谱，揭示miRNA 在病毒感染中具有重要作用[32]。然而，杆状病毒感染昆虫宿主后宿主编码的miRNA 相关研究较少[33]。据报道，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感 染Sf9 细 胞 后，miR-184 和let-7 表达量降低[34]；甜菜夜蛾核型多角体 病 毒（Spodoptera exiguanucleopolyhedrovirus，SeMNPV）感染甜菜夜蛾后，miR-2763 表达量显著上调，且该miRNA 在不同物种中具有高度保守性[35]。通过Solexa 测序技术在棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HaSNPV）感染的棉铃虫脂肪体组织中鉴定出127 个差异表达显著的宿主miRNA，其中63 个上调、64 个下调，明显改变了宿主miRNA 的表达谱，这为研究病毒侵染机制奠定了理论基础，为杆状病毒杀虫剂的应用提供了数据参考[36]。而对家蚕的研究是用感染和未感染家蚕核型多 角 体 病 毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV）的家蚕幼虫样品构建了2 个小RNA 文库，鉴定出373 个已知家蚕miRNA 和73 个新的家蚕miRNA，并证实了miRNA 的差异表达情况，为进一步研究miRNA的功能奠定基础[37]。

2.2 昆虫miRNA的功能

研究认为，miRNA 是参与宿主-病原体相互作用的重要角色。越来越多的研究（表1）利用深度测序技术检测了病原体入侵宿主后宿主miRNA 的变化[38]，如扰乱miRNA 的合成途径，抑制特定miRNA的表达等[39]。病毒感染宿主后，某些miRNA 可激发宿主免疫应答反应干扰病毒感染，而某些则被病毒利用促进自身复制和传播[40]。对已鉴定的家蚕miRNA 进行研究发现，一些家蚕miRNA 只在特定的发育阶段表达，如bmo-miR-277 仅在蛾中表达，bmo-miR-289 仅在蛹中弱表达，而另外一些miRNA（如bmo-miR-1）在家蚕的幼虫、蛹、蛾阶段均有较强的表达，这显示了特定的miRNA 可在昆虫不同发育阶段表达，提示miRNA 可能在昆虫发育过程中具有重要的调控功能[41]。BmNPV 感染家蚕后，通过抑制bmo-miR-8 的表达可显著增加BmNPV 在脂肪体中的传染性[42]。另有文献报道，杆状病毒感染草地贪夜蛾细胞时会引起宿主miRNA 的差异表达，导致miRNA 多样化，这显示了昆虫-病原体相互作用的复杂性[43]。AcMNPV 感染斜纹夜蛾幼虫时，miRNA bantam 表达水平升高，当过表达bantam 时，一些对病毒重要基因的表达量减少，而抑制bantam 活性会导致Sf9 细胞存活率下降并且斜纹夜蛾幼虫生长异常，这表明宿主在被AcMNPV 感染时会通过产生miRNA来抑制病毒扩散，达到抗病毒效应[44]。

表1 杆状病毒感染改变的宿主miRNA及作用靶基因Tab.1 Baculovirus infection-altered host miRNAs and their tested targets

miRNA 在杆状病毒-昆虫互作中的研究结果对利用杆状病毒防治害虫、进行基因治疗和疫苗研发等具有重要意义。杆状病毒感染宿主可操纵宿主的攀爬行为，诱导宿主爬到植物顶端死亡，以此促进病毒的传播，这一过程被称为树顶病[50]。据报道，保 幼 激 素（Juvenile hormone，JH）和 蜕 皮 激 素（20-hydroxyecdysone，20E）是HaSNPV 诱导棉铃虫上爬行为的关键成分，并且JH 和20E的下游关键基因BrZ2的敲除会促进HaSNPV 诱导的棉铃虫上爬行为；研究者还发现，miR-8和miR-429可直接调节BrZ2的表达，参与20E 和JH 信号通路的调节，并且过表达miR-8 和miR-429 会促进HaSNPV 的复制，提高染毒棉铃虫的死亡高度[36]。小菜蛾miR-8通过上调丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin27的转录水平阻断昆虫黑化反应Toll 通路的激活和酚氧化酶原的激活，从而使机体的体液免疫遭到破坏，表明miR-8在昆虫系统免疫稳态中发挥重要作用[51]。过表达bmo-miR-2819 可显著降低BmNPV ie-1 蛋白的丰度，过表达bmo-miR-217 显著抑制BmNPVlef-1基因的表达，影响BmNPV 的复制，这表明宿主miRNA可通过调控病毒基因的表达影响病毒感染[47-48]。JAYACHANDRAN 等[46]研 究 发 现，AcMNPV 感 染 棉铃虫后miR-14 显著下调，miR-14 正调控棉铃虫的蜕皮激素受体基因（H.armigeraecdysone receptor，Ha-EcR），蜕皮激素受体是昆虫发育过程中实现蜕皮的关键因素，表明杆状病毒可通过利用miRNA 改变宿主生理形态实现自身增殖最优化。研究发现，Se301 细胞中转染miR-2763 的模拟物，会抑制SeMNPV 复制和多角体产生，说明miR-2763能够响应SeMNPV 感染[35]。综合以上分析说明，miRNA 在病毒入侵宿主及在宿主体内增殖时具有重要的调节作用，miRNA 的调节作用有助于进一步了解昆虫宿主的先天性分子免疫机制。

3 杆状病毒编码的miRNA及其功能

3.1 杆状病毒编码的miRNA

迄今为止，已有95种昆虫杆状病毒完成了全基因组序列测定（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=10442）。自从2008 年报道昆虫病毒中第一个miRNA HvAv-miR-1 以来，目前已经发现400 多个病毒来源的miRNA，主要包括疱疹病毒、腺病毒、多瘤病毒、肠囊病毒和杆状病毒[11]。与疱疹病毒编码的200多个miRNA的研究情况相比，杆状病毒编码的miRNA研究较少，目前仅集中在斜纹夜 蛾 核 多 角 体 病 毒（Spodoptera lituranucleopolyhedrovirus， SpltNPV）[52]、 BmNPV[53]、AcMNPV[54]和黎豆夜蛾核型多角体病毒（Anticarsia gemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus，AgMNPV）[55]等少数病毒中（表2）。AcMNPV 和BmNPV 是基因组学和发病机制上研究最多的2 种杆状病毒[56]。BmNPV 可严重威胁家蚕养殖业并造成巨大的经济损失，使用VMir软件对BmNPV 基因组进行扫描，通过反转录PCR（RT-PCR）鉴定出5个可能由BmNPV基因组编码的miRNA 前体序列，根据前体分子发夹结构分析和RT-PCR 验证，最后确定6 个成熟体序列，同时利用高通量测序技术和RT-PCR 技术确定了7个miRNA 成熟体序列，并对某些miRNA 进行了功能预测，揭示了病毒miRNA 复杂的调控网络，为家蚕的病毒防治提供了新思路和新方法[57-58]。利用Solexa 技术对AcMNPV 感染的Sf9 细胞进行小RNA测序，通过生物信息学分析和试验验证，鉴定出5个来 自AcMNPV 的miRNA[54]。KHARBANDA 等[52]利用生物信息学预测出48 个SpltNPV 编码的miRNA，其中10 个miRNA 利用Northern blot 杂交和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术在SpltNPV 感染的Sf21细胞中得到证实，并且大多数miRNA 在感染72 h后达到较高表达水平。此外，研究人员基于种子区序列的保守性，用生物信息学方法筛选出了AgMNPV编码的miRNA AgMNPV-miR-4[55]。

表2 杆状病毒编码的miRNA及作用靶标Tab.2 Baculovirus-encoded miRNAs and experimentally verified targets

3.2 杆状病毒miRNA的功能

在病毒-宿主共同进化的过程中，病毒编码的miRNA 为病毒提供了生存优势[67]。这些miRNA 不仅控制了病毒的生命周期，还操纵了宿主免疫基因的表达，从而使其能在宿主细胞中成功繁殖[68-69]。尽管目前对杆状病毒产生的miRNA 功能的研究有限，但是它们具有与哺乳动物miRNA 类似的功能[70]。杆状病毒感染宿主后，可以某种特定的方式利用miRNA 进行增殖，参与调节宿主与病毒的基因网络，延长其生存时间，最终使宿主细胞裂解[71]。

利用miRanda 软件预测，AcMNPV-miR-1 可作用于病毒基因ac11、ac15、ac18、ac30、ac34、ac55、ac64、ac66、ac82、ac94、ac95、ac101、ac131和ac135[59]。在这些候选靶基因中，ac94得分最高，并且ac94编码的ODV-E25 蛋白位于包埋型病毒粒子（Occlusion derived virus，ODV）和芽生型病毒粒子（Budded virus，BV）的包膜中，这对于产生ODV 和BV 尤为重要[59]。双荧光素酶试验也证实了AcMNPV-miR-1 和ac94基因之间存在相互作用[60]。ac18和ac95也通过相同的试验得到了证实[61]。总之，过表达AcMNPV-miR-1可降低BV的传染性，减少病毒DNA 的复制，加速ODV 的形成。JIAO 等[62]研究发现，AcMNPV-miR-3可下调ac101的表达，过量的AcMNPV-miR-3 可减少BV 的产生，加速ODV的形成，这些结果表明AcMNPV-miR-3 可能在BV和ODV 的产生中起调节作用。病毒产生的miRNA也可通过降低病毒蛋白的表达降低其抗原性，从而逃避宿主免疫系统[72]。起初，人们认为病毒产生的miRNA 是为了对抗宿主基因，然而，最近的研究结果表明，病毒miRNA 介导的病毒基因调控对于病毒维持宿主内持续感染至关重要[54]。在病毒感染早期阶段，BmNPV-miR-3 通过负调控病毒DNA 结合蛋白（P6.9）和一些参与病毒组装的晚期基因的表达，使病毒保持最低病毒载量，自主控制BmNPV 的增殖，避免过度复制导致宿主过早死亡，并且在感染初期阶段，阻碍晚期基因的表达，调节宿主免疫反应，表明病毒可通过编码miRNA 逃避宿主早期免疫识别，且miRNA 在病毒持续感染宿主中起着至关重要的作用[64，73]。

在杆状病毒感染过程中，病毒编码的miRNA 可调控宿主基因，从而参与免疫反应[74]。病毒逃逸免疫反应的策略之一是抑制宿主miRNA 的数量，因为在某些情况下，宿主miRNA 可发挥抗病毒功能[75]。BmNPV-miR-1 就是通过这种策略来调节宿主防御，BmNPV-miR-1 下调宿主GTP 结合核蛋白Ran的表达，而Ran 是exportin-5 介导的核质运输机制的重要组成部分，主要参与miRNA 从细胞核到细胞质的运输，由于BmNPV-miR-1 抑制了Ran，导致宿主miRNA 种群减少，从而增加感染幼虫中BmNPV的数量[42]。WANG 等[54]研究发现，AcMNPV-miR-4可显著下调参与细胞凋亡的宿主基因，而对病毒基因却没有明显的抑制作用，这表明AcMNPV 编码的miRNA 可通过调节宿主基因来建立感染，从而在宿主-病毒相互作用中发挥功能。miRNA 不仅可以靶向病毒和宿主的基因，还可以与宿主miRNA 相互作用。CAO 等[65]研究发现，BmNPV-miR-415 可与宿主miR-5738 互作，这类miRNA 并未直接作用于宿主免疫相关基因，从而避免在病毒感染早期阶段刺激宿主免疫系统，确保宿主环境稳定，从而更好地感染宿主细胞，最终导致宿主免疫系统崩溃。

4 小结

miRNA 对于研究生命发育和疾病机制具有重要意义。自发现以来，其功能研究一直是人们关注的焦点，miRNA 在疾病、病毒免疫以及害虫防治、益虫保护等方面具有巨大的应用潜力，与基因编码蛋白质一样，miRNA 也能响应生物胁迫，该领域的研究结果为生物学研究提供了新方向和新思路[76]。在病毒学中，杆状病毒具有特殊地位，它们在不同领域中有不同的应用，作为真核表达载体系统，可广泛表达外源蛋白，用于表达免疫活性分子、药物研发以及疫苗生产等方面[77]；作为基因转移载体用于基因治疗[78]；作为生物杀虫剂用于控制农林害虫、保护环境等[79]。虽然在杆状病毒基因组中预测到大量可编码miRNA 的基因，但到目前为止，只有很少的杆 状 病 毒，即BmNPV、AcMNPV、SpltNPV 和AgMNPV 被报道编码miRNA[38，80]。与发现的宿主miRNA 相比，杆状病毒miRNA 较少，对其功能机制的研究也不深入，但随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，相信未来的情况将发生变化。杆状病毒通过编码miRNA 直接作用于病毒或宿主基因，或结合宿主miRNA，或控制自身增殖等影响宿主生理过程，从而逃避宿主免疫应答反应；昆虫宿主通过编码miRNA 调控自身或病毒基因，激活抵抗病毒感染的蛋白质，从而激活天然免疫系统，抑制病毒增殖[81]。

综上，从miRNA 角度阐述了杆状病毒-昆虫宿主之间的相互作用和协同进化，有助于理解基因表达调控网络和无脊椎动物的先天性免疫机制，为利用RNA 干扰（RNAi）技术进行害虫防治和益虫保护提供数据支持，并为杆状病毒杀虫剂的研发和应用提供理论支持。