不同化学型樟树精油的化学成分和抑菌效果研究

胡 珊，梁卫驱，黄 皓，侯 晨，陈杰连，徐 匆，罗华建，连辉明，陈仕丽，谢佩吾*

(1.东莞市农业科学研究中心，广东东莞 523000；2.广东省林业科学研究院，广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东广州 510520)

樟树(Cinnamomumcamphora)，又名香樟、乌樟、樟木、芳樟等，是亚热带地区重要的材用和特种经济树种，其根、木材、枝、叶均可提取精油[1]。樟树精油具有芳香气味和良好的防腐、消炎、抗病毒、杀菌、杀虫等活性，目前被应用于香料、医药和食品工业等行业，具有广阔的研究前景[2-3]。樟树精油成分因各个地域的环境、气候等差异而不尽相同。大多数学者根据樟树精油的成分所含的主要化学成分的不同将其划分为5种化学型：主含芳樟醇(17.30%～84.83%)的芳樟型、主含樟脑(10.00%～75.03%)的樟脑型、主含桉叶油素(30.70%～58.51%)的油樟型、主含异橙花叔醇(20.74%～42.00%)的异樟型、主含龙脑(67.06%～81.78%)的龙脑樟型[4-7]。不同化学型樟树精油的化学成分和理化性质不同，生物活性亦有差异。樟树精油的大多数化学成分有杀菌、抑菌的作用。Chen等[8]研究发现樟树精油对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌等具有良好的抗菌活性。陶翠等[9]研究发现油樟叶挥发油对须毛癣菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌 3株真菌具有较强的抗真菌活性。邓海英等[10]研究樟树叶乙醇提取物和水提取物对4种细菌的抗菌活性，结果表明2种提取物对G+菌及G-菌均有不同程度的抑制作用。胡小刚等[11]在芳樟醇R-和S-对映异构单体的体外抗菌活性研究中发现，2种芳樟醇对金黄色葡萄球菌等细菌均具有抗菌活性，R-芳樟醇对部分细菌抗菌活性稍强于S-芳樟醇。Pragadheesh等[12]研究发现樟树精油对瓜褐腐病有良好的抑制作用。有关樟树精油抑菌作用的研究已有较多报道，其中主要研究同种化学型对不同菌的抑菌作用，而针对不同化学型樟树精油对相同病原菌的抑菌作用比较分析鲜见报道。该研究选取应用较为广泛2种化学型(芳樟型和龙脑樟型)樟树，采用水蒸气蒸馏法提取2种樟树叶的精油，利用GC-MS 法对比分析2种樟树叶精油化学成分的差异，并以多种常见的农作物病害病原菌为研究对象进行抑菌作用研究，以期为拓宽樟树精油的开发利用思路和开发绿色安全植物病原菌防治药剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1新鲜樟树树叶。龙脑樟由广东华清园生物科技有限公司提供；芳樟由广东省林业科学研究院提供。

1.1.2培养基。马铃薯琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.1.3供试植物病原菌。甘蔗赤腐病菌(ColletotrichumfalcatumWent)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、花生褐斑病菌(CercosporaarachidicolaHori)、水稻恶苗病菌(FusariummoniliformeSheld)、苹果轮纹病菌(Physalosporapiricola)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)由华南农业大学植物病理系赠送。冬瓜根腐病菌(Fusariumsolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.momdicae)、冬瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(schl.)f.sp.benincasae)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)，由东莞市农业科学研究中心分离保存。

1.1.4试验设备。GCMS-QP2020W/O气相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)；TC-15套式恒温器(海宁市华星仪器厂)；YXQ-LS-75G立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SW-CJ-1F 洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；LRH-250 生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1精油提取[13]。采用《中华人民共和国药典》(2015版)附录XD水蒸气蒸馏法提取龙脑樟树叶和芳樟树叶叶片精油。为减少挥发，采摘回实验室的鲜叶在7 d内按照采样顺序完成精油提取工作。所得精油在0～5 ℃条件下保存，用于精油成分分析。

1.2.2樟树叶精油成分分析。

1.2.2.1气相条件(GC)。升温程序：初始柱温为70 ℃，以2 ℃/min 速度升温至160 ℃保持2 min，再以10 ℃/min速度升温至220 ℃，保持5 min，全程共运行51 min。进样量0.5 μL，采用分流的方式进样，进样口温度230 ℃。载气为氦气，过柱载气恒流速为1.19 mL/min。

1.2.2.2质谱条件(MS)。离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围(m/z)50～500。溶剂延迟3 min。

1.2.2.3化合物鉴定。将总离子流图中各峰经质谱扫描后得到质谱图，通过标准质谱图库进行检索分析鉴定，并采用峰面积归一定量法计算各组分在挥发油中的相对百分含量[14]。

1.2.3樟树叶精油抑菌作用。

1.2.3.1植物精油配制。在无菌条件下，将植物精油用3%吐温-80乳化剂溶液稀释配制为500 mg/L精油溶液。

1.2.3.2真菌病原菌抑制试验。用6 mm打孔器打取植物病原真菌菌饼移至PDA平板中央，在距菌饼约2 cm处等距离呈等边三角形的3点打孔，每个孔内加100 μL樟树叶精油溶液，每处理3次重复，以3%吐温-80乳化剂溶液为阴性对照，不添加任何物质的处理为空白对照。所有处理平板放置28 ℃培养至空白对照菌落长满，测量各处理的菌落直径，计算抑制率[15]。抑制率=(空白对照菌落直径-乳化剂处理菌落直径-精油处理菌落直径)/空白对照菌落直径×100%。

1.3 数据处理方法采用SPSS 17.0 及Microsoft Excel 2007 软件对试验数据进行统计分析，试验数据为平均值±标准差。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小显著性差异法(LSD)多重比较检验不同处理之间的差异显著性(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同化学型樟树叶精油的化学成分分析通过对不同化学型樟树叶精油GC-MS分析得到总离子流图进行谱库匹配和人工鉴定，使用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量，结果见表1。芳樟和龙脑樟2种精油经弱极性色谱柱分析鉴定出共52种化合物，精油成分组成以单萜类和倍半萜类为主，相对成分总含量分别99.31%、99.98%。

表1 2种不同化学型樟树叶精油的GC-MS 分析结果

芳樟精油共分析鉴定出39种化合物，其中醇类化合物9种，相对含量为73.50%；烯类化合物24种，相对含量为18.97%，此外，还鉴定出1种烃类、1种苯类、2种酚类、1种醚类和1种酮类化合物。该化学型精油中相对含量超过1%的主要化学成分有芳樟醇(53.73%)、反式-橙花叔醇(8.87%)、蒿酮(4.46%)、桉叶油醇(4.45%)、石竹烯(4.12%)、樟脑(3.33%)、α-石竹烯(3.29%)、顺β-罗勒烯(1.65%)、β-芘澄茄烯(1.49%)、α-松油醇(1.26%)、6-芹子烯-4-醇(1.09%)。

龙脑樟精油共分析鉴定出28种化合物，其中醇类化合物10种，相对含量为87.07%；烯类化合物12种，相对含量为9.63%，此外，还鉴定出1种烃类、1种酯类、3种酮类和1种酸类化合物。该化学型精油中相对含量超过1%的主要化学成分有龙脑(80.69%)、左旋乙酸冰片酯(2.84%)、α-石竹烯(2.46%)、石竹烯(2.18%)、氧化石竹烯(1.82%)、匙叶桉油烯醇(1.78%)、α-松油醇(1.41%)、樟脑(1.32%)、β-芹子烯(1.06%)。

2种化学型樟树叶精油共同鉴定出的化合物为15种。其中，8种烯类(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、石竹烯、α-石竹烯、氧化石竹烯)，6种醇类(桉叶油醇、α-松油醇、樟脑、龙脑、松油烯-4-醇、芳樟醇)，1种烃类(β-伞花烃)。这些化学成分与前人研究报道的不同化学型樟树的主要挥发性化合物一致[16]。芳樟精油中主要成分为芳樟醇，相对含量为53.73%。龙脑樟精油中主要成分为龙脑，相对含量为80.69%。

2.2 樟树叶精油抑菌作用该试验研究比较2种不同化学型樟树叶精油在500 mg/L浓度下对玉米小斑病等10种植物真菌病原菌的抑菌活性，结果如表2和图1～2所示。由表2和图1可知，2种樟树叶精油对甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻恶苗病菌8种病原菌均有不同程度的抑制作用，对苹果轮纹病菌和小麦赤霉病菌无抑制作用。

图1 2种不同化学型樟树叶精油的抑制作用

表2 2种不同化学型樟树叶精油对8种植物病原菌的抑菌菌落直径

由图2可知，2种樟树叶精油对不同真菌的抑菌率相差较大。其中，芳樟精油对8种病原菌抑制率在11.51%～71.51%，对苦瓜枯萎病菌和甘蔗赤腐病菌的抑制率达70%以上；龙脑樟精油对8种病原菌抑制率在10.89%～63.54%，对甘蔗赤腐病菌的抑制率最高。2种精油除对玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻恶苗病菌3种病菌的抑制作用无显著差异外，芳樟精油对其余5种病原菌抑菌效果均显著优于龙脑樟精油。此外，2种精油对甘蔗赤腐病菌均有较好的抑制作用。

注：不同小写字母表示同种植物病原菌不同化学型樟树叶精油间差异显著(P<0.05)

3 结论与讨论

樟树是我国亚热带常绿阔叶林中的重要组成树种，分布广泛，资源丰富，其精油成分富含芳樟醇、樟脑、1，8-桉叶油素、龙脑、异橙花叔醇和黄樟油素等重要天然成分。精油是樟树新陈代谢过程中次生代谢的产物，基因遗传表达、生境共同作用会导致它产生复杂的遗传变异，因种类、种植地、季节等因素的不同，樟树叶精油的产油率、化学成分、理化性质都不同[17]。因此掌握樟树精油的化学组成是对其进行开发利用的前提。该研究中芳樟、龙脑樟树叶提取水蒸精油进行化学成分分析鉴定出52种化合物，精油成分组成以单萜类和倍半萜类为主。芳樟精油分析鉴定出39种化合物，其中醇类化合物9种、烯类化合物24种，主要成分为芳樟醇(53.73%)。龙脑樟精油分析鉴定出28种化合物，其中醇类化合物10种、烯类化合物12种，主要成分为龙脑(80.69%)。该研究中芳樟、龙脑樟树叶采自广东省，其化学成分分析结果与付宇新等[18]研究采自江西省的2种同化学型樟树叶提取精油的分析结果不一致。而该研究中龙脑樟树叶精油化学成分分析结果与丁雄等[19]研究同样采自广东省的龙脑樟树叶精油的分析结果较为接近，主要成分龙脑的含量分别为80.69%和81.58%。这说明不同地区相同化学型的樟树叶精油的主要成分存在一定的差异。

近年来，樟树精油的生物活性研究备受关注。已有研究报道芳樟型和龙脑樟型樟树精油具有良好的抑菌活性。丁雄等[19]研究发现龙脑樟叶水蒸挥发油及其主要成分右旋龙脑对试验所选的细菌、酵母菌和霉菌3类微生物均表现出一定的抗菌效果。郑红富等[20]采用水蒸气蒸馏法提取芳樟精油主要成分芳樟醇为 89.58%，采用菌丝生长速率法测试质量浓度为500、250和125 mg/L 时芳樟精油对水稻纹枯病菌具有良好的抑菌活性，抑制率分别为100%、90.88%和67.94%。目前，2种化学型樟树精油对不同菌的杀菌作用研究较多，而2种化学型樟树精油对同种菌抑制作用的比较还鲜少研究。该研究比较2种不同化学型樟树精油在500 mg/L 浓度下对玉米小斑病等10种植物真菌病原菌的抑菌活性，2种樟树精油对甘蔗赤腐病菌、玉米小斑病菌、冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌、苦瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻恶苗病菌8种病原菌均有不同程度的抑制作用，对苹果轮纹病菌和小麦赤霉病菌无抑制作用。2种精油除对玉米小斑病菌、冬瓜枯萎病菌、水稻恶苗病菌3种病菌的抑制作用无显著差异外，芳樟精油对其余5种病原菌抑菌效果均显著优于龙脑樟精油。该研究结果为芳樟和龙脑樟樟树叶精油的开发利用提供理论依据。