基于生物信息学和体外实验探讨粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路

梁 超，周家伟，刘亚锋，郭健强，王清森，苏忆欣，邢应如，胡春晓，谢 军，吴 静，2，3，胡 东，2，3

（1. 安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001；2. 安徽省职业健康安全工程实验室，安徽 淮南 232001；3. 工业粉尘深度净化与职业健康安全安徽省教育厅重点实验室，安徽 淮南 232001；4. 安徽中科庚久医院检验科，安徽 合肥 230000；5. 安徽理工大学附属肿瘤医院/淮南东方医院集团肿瘤医院，安徽 淮南 232033）

矽肺是由于吸入二氧化硅或二氧化硅刺激的肺纤维化疾病，是最常见的职业性疾病之一。中国是矽肺患者最多的国家，平均年确诊病例超过5 000例，死亡病例超过20 000 例。全球矽肺患者中欧洲超过300 万，美国超过200 万［1］。矽肺常与巨噬细胞受体激活、炎症小体有关，二氧化硅吸入肺后被巨噬细胞吞噬，巨噬细胞释放炎症因子刺激上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞的募集，成纤维细胞被刺激后分化为肌成纤维细胞，产生胶原纤维［2，3］。已证明二氧化硅可以刺激PI3K 蛋白激酶调节自噬体积累从而促进矽肺发展［4］，也可以通过抑制NFκB 或TGF-β 抑制矽肺进程［5］，但人们对早期矽肺的关键通路并不清楚，无有效的手段可以进行早期矽肺的识别、诊断和治疗［6］，所以对早期矽肺的深入研究有着重要的临床意义和社会意义。

根据矽肺证型的特点，古代中医学家利用中药以补为法，以通为用，通补兼施治疗矽肺，中药防己就是其中之一［7］。防己入药历史悠久，在《神农本草经》《伤寒杂病论》《药性论》等古书中均有记载，防己在《神农本草经》中记载味苦性寒，具有治疗风湿水肿、湿疹脉浮的功效［7］。在现代医疗中具有抗肿瘤，抗风湿性关节炎，保护心血管等作用。研究表明粉防己主要的化学成分是粉防己碱（tetrandrine），为喹啉类生物碱，具有抗肿瘤，抗炎、抗纤维化。抗矽肺等药理作用［7］。临床研究表明粉防己碱素治疗矽肺的临床效果显著，可以改善患者的肺功能水平［8］。同时发现粉防己碱可以减少脂多糖诱导的巨噬细胞的爆发［9］，减少氧自由基的产生和肿瘤坏死因子-α（TGF-α）。白介素-6（IL-6）等炎症因子的积累，延缓矽肺前期的炎症阶段，减少胶原纤维的产生，改善肺部纤维化形成［10］。本研究基于前期课题组的中药研究成果，采用矽肺患者基因、二氧化硅滴注小鼠基因和网络药理学三种数据集进行筛选和预测，通过分子对接和体外实验验证，探究粉防己碱治疗早期矽肺的关键通路，为早期矽肺的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 芯片及靶点基因

矽肺患者的相关芯片数据来源于文献，本研究收集了10 例矽肺患者和7 例正常人的肺组织RNA测序数据进行分析，10 例矽肺患者和7 例正常人的肺组织均来自于无锡市人民医院，肺组织在肺移植时获得，取样时避开了淋巴结和器官，所有参与者都给出书面知情同意书且获得了南京医科大学机构审查委员会和中国医学科学院基础医学研究所的批准［11］。二氧化硅滴注大鼠的相关芯片数据来自 于GEO 数 据 库［12］（the Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。在GEO 数据库搜索关键词“矽肺”，经筛选得到芯片原始数据GSE188520 以及平台注释文件GPL2 5290，其中GSE188520 中样本包括6 只普通大鼠和6 只二氧化硅滴注大鼠。通过使用limma 包［13］对上述芯片数据进行差异化分析，差异基因的筛选条件为P＜0.05，log（fold change，FC）＞1 或＜-1，将筛选后的基因按照log FC 绝对值大小进行排序，上调和下调排名前一百的基因进行后续分析。

1.2 矽肺靶点的收集

在OMIM 数据库［14］、CTD 数据库［15］、GeneCard数据库［16］中以“矽肺”为关键词进行检索，运用靶点交集可视化工具［17］将交集靶点进行提取构建。

1.3 功能富集分析

为说明筛选出的关键基因和靶点参与的信号通路和发挥的生物学功能，使用R studio 软件并利用R/ggplot2、limma、pheatmap、ggsci、dplyr 包对关键差异基因进行了基因本体分析和信号通路富集分析［18］。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用图

不同基因集筛选出来的通路进行交集得到关键通路，将关键通路相关靶点导入STRING 数据库［19］，物种设置为“Home sapiens”，保存下载文件为tsv 格式，导入cytoscape 3.8.0 进行美化后得到关键蛋白［20］。

1.5 分子对接

在PDB［21］数据库中关键蛋白的格式化学结构，下载为PDB 格式。在PubChem［22］中下载粉防己碱的化学结构，保存为SDF 格式。利用Schrodinger 软件中的Protein Preparation Wizard 进行蛋白结构优化，选择保留或删除链、水域和配体等，修复填充丢失的侧链以及进行能量最小化。在Review and Modify 选项中进行配体、水位置和电荷校正，在Refine 选项中进行最后蛋白结构的优化。通过Lig-Prep 进行配体准备，加氢、去盐、中和带电基团、产生质子化状态最后产生互变异构结构。软件的Ligand Docking 模块用于分子对接，通过结合能来评价药物与蛋白结构的亲和力，最后用pymol 修饰表现。

1.6 MTS 检测细胞凋亡率

用PBS 清洗培养皿两遍后，用胰酶消化细胞，根据细胞状态不同选择合适的胰酶消化时间，胰酶消化后吸取到15 mL 离心管中，离心5 min，转速为5 000 r/min，离心后上清液倒掉，用PBS 清洗再次离心5 min，转速为5 000 r/min。倒上清液后加1 mL 培养液制备细胞悬液，准备计数，将细胞接种到96 孔板，调整细胞浓度在5×103左右，每孔加入培养基100 μL，每个样本重复3～5 孔，在37 ℃培养箱培养约6 h 后加入不同浓度的药物，放入培养箱24 h后，每孔加入MTS 溶液20 μL，再次放入培养箱4 h后测定吸光度值。

1.7 Q-PCR 测定细胞炎症因子表达

将细胞样品用PBS 洗净加入1 mL Trizol，在冰上放置5 min，吹打混匀后放入1.5 mL 无RNA 酶EP 管中，加入氯仿200 μL，震荡混匀静置10 min。4 ℃12 000 r/min 离心15 min，用无RNA 酶枪头吸取上清液加入到500 μL 异丙醇中震荡静置10 min，4 ℃12 000 r 离心10 min 收集RNA 沉淀，用75%无水乙醇洗涤后离心5 min 去上清，自然风干后加入适量DEPC 水溶解沉淀。随后上机测RNA 浓度，各组RNA 量调整到同一水平，配置逆转录体系。逆转录完成后将cDNA、荧光染料和不同引物配置成不同的混合体系上机。

1.8 Western blot 检测蛋白表达

将细胞样品用PBS 洗涤后，根据细胞量的多少，加入还有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，4 ℃冰箱放置30 min 后，取细胞混合液离心，去上清取沉淀，测量不同组的细胞浓度并调整到同一浓度。各组蛋白用8%SDS-PAGE 分离蛋白，在冰水中电转80 min，将蛋白转模至PVDF 膜，用BSA 封闭液封闭1 h 后与一抗结合，放入4 ℃冰箱过夜，洗膜后与二抗结合60 min，再次洗膜后上机，最后获得的电泳条带图［23］。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 矽肺差异基因表达筛选

为了揭露矽肺差异基因表达情况，首先分析7例正常人和10 例矽肺患者的肺实质的单细胞测序情况［11］，共获得2 065 个差异基因，将数据标准化后根据limma 包的分析，分别筛选出上调和下调基因各100 个。其次从GEO 数据库中下载表达谱芯片数据GSE188520，其中包括了6 只正常大鼠和6 只二氧化硅诱导大鼠，共获得2 291 个差异基因，通过R 包的差异基因筛选，分别筛选出上调和下调基因各100 个。最后利用网络药理学通过Genecards、CTD、OMIM 数据库检索，共得到与矽肺疾病相关803 个基因，通过绘制UpSet 图，获得交集基因129个，上述基因被认为是与矽肺有密切联系的基因。见图1。

图1 关键矽肺差异基因筛选Fig 1 Screen of key silicosis differential genes

2.2 矽肺关键差异基因KEGG 通路富集分析

首先将正常人与矽肺患者的差异基因进行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 为标准，共筛选出13 条KEGG 通路，其中细胞外基质-受体相互作用（ECM-receptor interaction）与纤维化的形成有关。人瘤病毒感染（human papillomavirus infection）与细胞周期及凋亡有关，IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）与细胞的生长、分化、炎症等有关。其次将网络药理学数据库的交集基因通路富集后共筛选出166 条通路，主要的信号通路有AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、受体因子相互作用信号通路等。最后将矽肺大鼠的差异基因进行通路富集后筛选出22 条通路，主要有胃酸分泌、IL-17 信号通路、疟疾、阿米巴病等信号通路有关，分析结果表明IL-17 信号通路可能是影响矽肺的关键通路。见图2。

图2 差异基因KEGG 通路分析Fig 2 Analysis of differential gene KEGG pathway

2.3 GO 富集分析

通过R 语言对矽肺患者的差异基因进行GO 分析，结果显示共有282 个生物过程、33 个细胞组分和35 个分子功能。其中主要结果包括纤毛运动、细胞外基质组织、T 细胞的活化、参与免疫反应中中性粒细胞的活化等生物过程，G 蛋白偶联受体结合、胶原蛋白结合、生长因子结合、Wnt 蛋白结合等分子功能，活动纤毛、含胶原纤维的细胞外基质、基底膜等细胞组分。其次对网络药理学数据库进行GO 分析，结果显示了2 576 个生物过程、66 个细胞组分和142 个分子功能，生物过程包括对脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应、活性氧代谢过程、调节炎症反应等，分子功能包括细胞因子受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、受体配体活性、G 蛋白偶联受体结合等，细胞组分包括囊泡腔、转录调节因子复合物等，最后对矽肺大鼠的差异基因进行GO分析，包括Toll 样受体信号通路、细胞对肿瘤坏死因子反应、细胞对生物刺激反应等生物过程，糖胺聚糖结合、G 蛋白偶联受体结合、趋化因子活性等分子功能，细胞组分与上述两组细胞组分大体相同。见图3。

图3 差异基因GO 富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of differential gene

2.4 PPI 网络图

PPI 网络图中，靶基因用节点表示，靶点之间的连线代表基因之间的相互作用，将最低互动分数设置为最高置信度。将IL-17 信号通路所包含的靶基因导入STRING 数据库，按照节点之间的交互分数由高到低进行排列，分数较高的靶基因大多与MAPK 信号通路有关，且这些靶点大多与炎症过程有关，说明IL-17 信号通路中可能起关键作用的是MAPK 信号通路，从而促使炎症因子高表达促进矽肺的发展。见图4。

图4 IL-17 信号通路蛋白互作图Fig 4 IL-17 signaling pathway protein interaction

2.5 分子对接结果

将IL-17 信号通路的关键蛋白与小分子化合物粉防己碱进行分子对接，确定两者结合位置即活性口袋大小，并显示出小分子和关键蛋白之间氢键作用位置。 对接亲和力分数通过薛定谔软件（Schrödinger）计算得出。分子对接结果表明，粉防己碱与MAPK 通路中的关键靶点RAF、ERK 之间有良好的结合力。以上结果间接证明，粉防己碱可能通过调控MAPK 信号通路中的RAF/MEK/ERK通路发挥关键作用，从而对早期矽肺产生影响。见图5。

图5 粉防己碱与通路蛋白对接模式图Fig 5 Docking of tetrandrine and pathway protein pattern diagram

2.6 细胞实验

2.6.1 粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡率的影响 在巨噬细胞系THP-1 中，随着药物浓度增加，粉防己碱抑制巨噬细胞增殖的能力逐渐增强，当药物浓度为5 μmol/L 时，细胞的凋亡率为20%，当药物浓度为10 μmol/L 时，细胞的凋亡率为83%，数据显示当加药浓度大于5 μmol/L，细胞凋亡率明显增加，不适合用于细胞实验，在巨噬细胞中加药浓度设置为5 μmol/L 是最适浓度。在上皮细胞系BEAS-2B 中，随着药物浓度的增强，上皮细胞的凋亡率呈线性增长趋势，在5 μmol/L 时，细胞的凋亡率为5%，在10 μmol/L 时，细胞的凋亡率为16%。根据对不同加药浓度时细胞凋亡率的计算，当加药浓度为20 μmol/L 时，是效果最佳的浓度。见表1。2.6.2 粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞中TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 水平的影响 TNF-α 主要由巨噬细胞和活化T 细胞释放，不但可以刺激其他促纤维因子，还可以刺激TGF-β 促进胶原的形成。IL-1β、IL-1α 可诱导吸附炎症细胞，调节其他炎症因子，促进成纤维细胞的增殖。利用PCR 检测加硅组和加药组中炎症因子的表达。与正常组相比，巨噬细胞加硅组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表达均升高（P＜0.05），其中TNF-α 和TGF-β 的表达显著上升（P＜0.01），与加硅组相比，粉防己碱组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表达明显下降（P＜0.05），其 中TNF-α 的 表 达 量 下 降 最 为 显 著P＜0.001）。与正常组相比，上皮细胞加硅组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表达均升高（P＜0.05），其中TNF-α 的表达显著上升（P＜0.001），与加硅组相比，加药组的TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 的表达明显下降（P＜0.05）。见表2。

表1 粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of tetrandrine on apoptosis of macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

表1 粉防己碱对巨噬细胞和上皮细胞凋亡的影响（n=3，±s）Tab 1 Effect of tetrandrine on apoptosis of macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

细胞巨噬细胞F P分组(μmol/L)5 10 50 100 5 10 50 100凋亡率（%）22.01±1.53 82.98±3.80 87.05±1.20 83.27±0.88 4.50±0.82 15.68±0.64 72.51±2.60 78.18±0.80 358.30＜0.000 1上皮细胞433.70＜0.000 1

表2 各组巨噬细胞和上皮细胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 炎症因子的表达情况（n=3，±s）Tab 2 Expression of TNF-α，TGF-β，IL-1β，IL-1α in macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

表2 各组巨噬细胞和上皮细胞TNF-α、TGF-β、IL-1β、IL-1α 炎症因子的表达情况（n=3，±s）Tab 2 Expression of TNF-α，TGF-β，IL-1β，IL-1α in macrophages and epithelial cells（n=3，±s）

细胞指标F P巨噬细胞TGF-α 27.78＜0.001 TNF-β 65.94＜0.000 1 IL-1α 19.45＜0.01 IL-1β 27.83＜0.01上皮细胞TGF-α 35.02＜0.001 TNF-β 24.91＜0.01 IL-1α 46.10＜0.001 IL-1β分组Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet表达量1 2.92±0.38 1.19±0.47 1 2.49±0.30 1.47±0.25 1 1.41±0.26 0.35±0.25 1 1.37±0.25 0.49±0.06 1 2.47±0.21 0.78±0.41 1 4.43±1.25 0.49±0.29 1 2.333±0.43 0.39±0.06 1 2.74±0.59 0.52±0.19 31.97＜0.001

2.6.3 粉防己碱对上皮细胞中E-Cadherin、N-Cadherin 和Vimentin 水平的影响 上皮间质转化在矽肺进展中起到重要作用，上皮细胞损伤可以导致转化从而诱发肺纤维化，在转变的过程中，上皮细胞标志物E-cadherin 的表达降低，而间充质细胞标志物N-cadherin 和vimentin 逐渐升高，使上皮细胞向成纤维细胞转化。利用WB 检测上皮间质转化相关蛋白的表达，正常组相比，加硅组的E-Cadherin 表达显著下降（P＜0.01）、N-Cadherin 表达显著上升（P＜0.000 1）、Vimentin 表达升高但并不显著。相较于加硅组，加药组的E-Cadherin 表达显著上升（P＜0.01）、N-Cadherin 表达显著下降（P＜0.000 1）、Vimentin 表达下降但没有统计学意义。结果证明粉防己碱起到抑制上皮细胞进行上皮间质转化的作用。见图6 及表3。

表3 各组BEAS-2B 上皮细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表达情况（n=3，±s）Tab 3 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group（n=3，±s）

表3 各组BEAS-2B 上皮细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表达情况（n=3，±s）Tab 3 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group（n=3，±s）

指标F P分组 表达量E-Cadherin Control Silicon Tet Control Silicon Tet Control Silicon Tet 1.000 0±0.000 0 0.490 0±0.105 3 1.070 0±0.147 3 1.000 0±0.000 0 1.350 0±0.053 4 0.366 6±0.030 5 1.000 0±0.000 0 1.100 0±0.245 8 0.700 0±0.185 9 27.500＜0.001 N-Cadherin 651.200＜0.000 1 Vimentin 4.875 NS

图6 各组BEAS-2B 上皮细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 蛋白的表达情况Fig 6 Expression of E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin protein in BEAS-2B epithelial cells in each group

2.6.4 粉防己碱对巨噬细胞中磷酸化后的RAF 及ERK 蛋白水平的影响 RAF 蛋白是由RAF 基因编码的蛋白激酶，在MAPK 信号通路中起着重要作用，RAF 蛋白可以调节下游的MEK 蛋白和ERK 蛋白活性，从而调控细胞的增殖，凋亡，炎症反应等功能。利用WB 检测MAPK 相关蛋白的表达，与正常组相比，加硅组的RAF 蛋白和ERK 蛋白的磷酸化水平明显升高（P＜0.01）。与加硅组相比，粉防己碱组的RAF 蛋白和ERK 蛋白的磷酸化水平明显降低（P＜0.000 1），证明粉防己碱可以抑制RAF 蛋白和ERK 的磷酸化水平，从而参与细胞的功能调节。见图7 及表4。

表4 各组THP-1 巨噬细胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2蛋白的表达情况（n=3，±s）Tab 4 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

表4 各组THP-1 巨噬细胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2蛋白的表达情况（n=3，±s）Tab 4 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

指标F P分组 表达量Phospho-c-Raf 64.04＜0.000 1 Phospho-ERK1/ERK2 Control Silicon Tet Control Silicon Tet 1.000 0±0.000 0 1.330 0±0.111 7 0.700 0±0.035 9 1.000 0±0.000 0 1.556 0±0.088 8 0.831 2±0.029 6 147.7＜0.000 1

图7 各组THP-1 巨噬细胞Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 蛋白的表达情况（n=3，±s）Fig 7 Expression of Phospho-c-Raf、Phospho-ERK1/2 in THP-1 macrophage cells in each group（n=3，±s）

3 讨论

矽肺是一种常见的职业病，主要是肺部炎症和纤维化，严重时会导致心脏衰竭，具有不可逆性。大多矽肺患者就诊时已是晚期，严重影响患者生活质量，且预后较差，当前矽肺治疗并不乐观［24，25］。近年来，矽肺的治疗手段和发病机制逐渐成为了热点话题，相关文章对矽肺发病机制进行了集中讨论，甚至有小部分方法在矽肺模型中成功开展［3］，但对矽肺发展机制的相关研究仍然不足。粉防己碱是从中药汉防己植物中提取出的药物，是一种用于治疗矽肺的临床药物［26］，因治疗癌症和肿瘤的效果被人所熟知［27，28］。研究报道，粉防己碱在抑制炎症反应、调节氧化应激有着显著作用［10］。因此本研究从生物信息学和网络药理学的角度出发，进一步探讨粉防己碱治疗早期矽肺的作用机制，为之后的临床研究提供理论基础。

生物信息学和网络药理学已经成为了研究疾病通路和关键蛋白的重要手段，本研究首次将矽肺患者、二氧化硅滴注大鼠的RNA 测序数据和网络数据库中与矽肺相关的靶点进行同步分析，从不同物种，不同来源的数据中分析影响早期矽肺的信号通路。研究表明矽肺的发展与多种信号通路都有着密切的关系。Zhang 等［29］通过使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制了NF-κB 信号通路介导的矽肺早期肺部炎症发生。Abd Elhameed［5］发现阿司匹林和磷虾油可以使二氧化硅小鼠肺组织中的NFκB 和炎症因子TGF-β1 下调，从而降低二氧化硅诱导的肺损伤。Yan 等［30］证明了PI3K/Akt 通路在二氧化硅诱导的肺纤维化中起到了关键作用。Helal等［31］通过使用β 受体阻滞剂卡维地洛降低小鼠肺组织内病P-AKT 和mTOR 含量从而减轻了二氧化硅诱 导 的 肺 纤 维 化。 Wu 等［32］发 现 大 黄 蛰 虫 丸（DHZCP）可 以 通 过 调 整p38 MAPK/TGF- β1 /Smad 通路，减少炎症因子的刺激从而抑制矽肺进展。 Yan 等［33］利 用p38 MAPK 特 异 性 抑 制 剂SB203580 发现P38 MAPK 通路是大鼠矽肺纤维化和EMT 的关键。有文章提及炎症因子IL-6 通过JAK2/STAT3 诱导胃癌细胞的EMT，同时IL-6 也可以通过STAT3 信号诱导FMT 的发生［34］。Cheng等［35］发现二甲双胍通过抑制TGF -β1 信号减轻成纤维细胞的活化，抑制巨噬细胞的炎症反应。报道表明影响矽肺发展的通路不止一条，但哪条通路才是影响矽肺最为关键的通路还没有定论。从GO 和KEGG 富集分析中发现三种不同数据集都存在IL-17 信号通路［36］，说明IL-17 信号通路在早期矽肺发展中有着极其重要的作用。相关文献证实，IL-17是白介素家族重要的炎性细胞因子，高水平的IL-17 导致肺部疾病恶化、包括肺炎、哮喘等疾病，吡非尼酮可以通过抑制IL-17A 的分泌来改善二氧化硅诱导小鼠的肺部炎症，其观点与本研究所得出的结论一致，证实IL-17 信号通路在矽肺的发展中有着重要作用。

PPI 网络图表示了不同靶点之间的相互作用，其结果证实MAPK 通路在IL-17 信号通路中起着重要作用，IL-6、TNF-α、CCL2 等靶点在PPI 网络图有着较高的影响分数，Tripathi 等［37］证明IL-6 的表达与二氧化硅诱导的肺纤维化有着密切关系，Cheng等［35］证明TNF-α 表达减少可以减少成纤维细胞的活化。CCL2 是一种介导炎症的趋化因子，可以促使巨噬细胞释放炎症因子从而促进矽肺早期的进展，以上靶点都说明筛选出的IL-17 信号通路在早期矽肺中起到重要的作用。

粉防己碱被药监局批准是治疗矽肺的新药，从本草粉防己提炼而出，在抗炎、抗纤维化、免疫应答、抗氧化方面都有着重要作用，但其抗纤维化的治疗效果仍存在争议，且粉防己碱在矽肺进展中影响的机制还未被确定［38］。本研究通过实验发现粉防己碱可以抑制关键通路RAF 和ERK 蛋白的磷酸化水平和EMT 的发生，其中上皮细胞标志物ECadherin 上调、间充质细胞标志物N-Cadherin 和Vimentin 表达下调。PCR 实验发现，粉防己碱明显抑制巨噬细胞和上皮细胞中IL-6、TNF-α、TGF-β 炎症因子的表达。

综上所述，粉防己碱对早期矽肺的发展有明显抑制作用，预测其机制是降低RAF/MEK/ERK 通路磷酸化，抑制早期矽肺组织中上皮细胞向间质细胞的转化，降低巨噬和上皮细胞炎症因子的释放水平，从而影响早期矽肺的进展。研究为矽肺治疗提供了理论依据和实验基础，为矽肺药物的研发和后续进一步的发展奠定了基础。本研究在数据采用方面仍有局限性，大部分数据来自数据库，可能存在数据不全的情况，关键通路验证只停留在细胞水平，未能在动物体内进行验证，粉防己碱治疗早期矽肺的机制还需更加深入研究。

作者贡献度说明：

梁超:文章构思，实验设计，生物信息学和网络药理学分析，细胞实验操作;周家伟、刘亚峰:生物信息学分析的指导和调整;郭健强、王清森:实验操作帮助。苏忆欣、胡春晓:实验数据分析;谢军、邢应如、胡东、吴静:论文撰写与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。