基于4D 蛋白组学分析RhoE 基因敲除对糖尿病大鼠心脏组织中蛋白质表达的影响及机制

赵 鋆，施凯佳，伍彩霞，邹 园，吴林栩，陈 旭，申志华，郭峻莉，揭 伟

（1. 海南医学院第一附属医院海南省热带心血管病研究重点实验室，海南 海口 571199；2. 广东医科大学基础医学院病理学系，广东 湛江 524023；3.海南医学院第一附属医院内分泌科，海南 海口 571199）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指不能用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病及其他已知病因的心脏病变来解释的糖尿病并发的心肌疾病［1，2］，其发病机制复杂迄今尚未阐明。因此，寻找合适的生物标志物为DCM 的预防及治疗具有极其重要的意义。近年来发展的转录组学［3］、蛋白组学［4］、代谢组学［5］、修饰组学［6］等研究都为此提供潜在的方案。

RhoE，也称Rnd3，为Rho 家庭GTPase 蛋白质超家族成员之一。RhoE 功能多样，与细胞增殖、周期、凋亡、迁移及分化等生物学功能有关［7］。文献报道，RhoE 表达异常与较多的心血管疾病有关［8-10］。前期基于CRISPR/Cas9 技术构建了RhoE 基因稳定敲除的H9C2 心肌细胞系，通过芯片筛查差异表达基因并富集RhoE 有关的信号途径，发现RhoE 参与调控胆固醇生物合成途径、oncostatin-M 信号、干扰素信号及TGF-β1 信号等，凸显了RhoE 在心脏疾病中的重要角色［11］。迄今，有关RhoE 与DCM 相关研究未见报道。

4D 蛋白质组学作为一种高通量差异表达蛋白质筛选方法，近年来受到较多的关注［12，13］。本研究拟采用4D 非标记定量蛋白质组学技术，检测RhoE表达改变在糖尿病大鼠心脏组织中蛋白质表达谱，表征其心脏组织中调控的差异表达蛋白质，结合生物信息学手段来挖掘在差异表达蛋白质涉及的功能、分布及参与的相关信号通路，为解析RhoE 在DCM 中的角色提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂：链脲佐菌素（YEASEN，中国），二硫苏糖醇、三氟乙酸、三氯甲烷、尿素、四甲基乙二胺、Seppro®Rat Spin Columns（Sigma-Aldrich，美 国），乙腈、甲醇、TMT 标记试剂、蛋白标志物（Thermo-Fisher Scientific，美国），PAGE 银染试剂盒、DNA提取酚试剂（北京Solarbio），Pierce Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns、硝酸纤维过滤膜、聚偏氟乙烯（Bio-Rad Laboratories，美国）。

主要仪器：NanoElute、高分辨质谱仪Bruker timsTOF Pro、超声仪（ThermoFisher Scientific，美国），电泳仪、电泳槽、转膜槽（Bio-Rad，美国）。

1.2 实验动物及分组

成年RhoE 基因全身敲除的杂合子Sprague Dawley（SD）大鼠（RhoE+/-，雄性，体重200～250 g），野生型SD 大鼠（雄性，6 周龄，体重200～250 g）由江苏赛业生物科技有限公司提供，饲养于广东医科大学实验动物中心病进行繁育和基因型鉴定［14］。采用高脂饲料配合一次性链脲佐菌素（70 mg/kg）联合构建糖尿病大鼠模型，给予链脲佐菌素注射2周后，连续3 次空腹血糖值≥16.7 mmol/L，取各组心脏组织用于蛋白组学研究。分组如下：正常对照大鼠（WT_NG），即WT 大鼠予以腹腔注射等量柠檬酸钠盐水；糖尿病大鼠（WT_HG），即WT 大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导成1 型糖尿病；RhoE 敲除对照大鼠（KO_NG），即RhoE+/-腹腔注射等量柠檬酸钠 盐 水；RhoE 敲 除 糖 尿 病 大 鼠（KO_HG），即RhoE+/-腹腔注射链脲佐菌素诱导成1 型糖尿病。动物均饲养于SPF 级环境，糖尿病组予以高脂饮食和常规饮水，对照组予以常规饮食和饮水。所有实验操作均符合广东医科大学实验动物伦理要求（伦理 编 号：GDY2016003）。 每 组 大 鼠 均 为3 只（n=3）。

1.3 蛋白提取与酶解

参考文献所述方法进行［15，16］。研钵用液氮预冷后置入适量心肌组织样品，加入液氮后将组织块完全研磨成粉末状。每组样品加入4 倍粉末体积的裂解缓冲液（含1%蛋白酶抑制剂，50 mmol/L 烟酰胺3 μmol/L 去乙酰化酶抑制剂，8 mol/L 尿素），行超声裂解。离心（4 ℃，12 000g，10 min）后将上清液转移到另一无菌离心管，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取等量各样品蛋白，用裂解液调整各组体积至一致。轻柔地加入20%三氯乙酸，涡旋后充分混匀，4 ℃沉淀2 h 后离心，用冷丙酮洗涤沉淀3 次。将沉淀置于超净台晾干，加入200 mmol/L 的四乙基溴化铵后用超声打散，按蛋白酶∶蛋白=1∶50 的比例加入胰酶，过夜酶解。加入二硫苏糖醇调节终浓度为5 mmol/L，56 ℃反应30 min，最后加入碘乙酰胺，调节终浓度至11 mmol/L，各样品避光孵育15 min 后备用。

1.4 液相色谱-质谱联用分析和数据分析

利用杭州景杰公司的技术平台完成有关色谱-质谱分析，实验步骤参考相关报道［15-17］。将含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液混合，配制成流动相A；含0.1%甲酸和100%乙腈溶液混合，配制成流动相B。用液相色谱流动相A 相溶解各样本的肽段，Nano Elute 超高效液相系统分离。设置液相梯度为0～70 min，6%～24% B；70～84 min，24%～32%B；84～87 min，32%～80% B；87～90 min，80% B，维持流速为450 nL/min。超高效液相系统分离肽段后加入Capillary 离子源中电离，随后timsTOF Pro 质谱分析电离后的肽段，设置离子源电压为1.7 kV，使用timsTOF Pro 质谱检测和分析肽段母离子及其二级碎片。设置二级质谱扫描区间为100～1 700。设置数据采集模式为平行累积串行碎裂（PASEF）模式。使用Maxquant（v1.6.15.0）对二级质谱数据进行检索，搜索到Rattus_norvegicus_10116_PR_20201214.fasta 共2 9940 条序列。添加反库后计算随机匹配造成的假阳性率（FDR），调整蛋白质和多肽的错误发现率为1%。在搜库完成后，需要进行一系列质控，保证结果质量符合标准。将差异表达量变化（FC）＞1.5 同时P＜0.05 设置为表达显著上调，FC＜1.5 且P＜0.05 设置为表达显著下调。

1.5 生物信息学分析

对各比较组中差异表达蛋白质分别进行GO 分类和KEGG 通路富集分析，通过Fisher 精确检验，评价差异表达蛋白质富集的功能分类和通路的显著水平。应用分层聚类方法绘制聚类热图。将不同比较组中差异表达蛋白质数据库编号或蛋白序列比对STRING（v.11.0）蛋白网络互作数据库，按照confidence score ＞0.7 提取得到差异蛋白互作关系。

2 结果

2.1 蛋白质鉴定与解析

各组大鼠心脏酶解后的蛋白经BCA 定量分析后符合质谱分析要求。通过液相色谱-质谱联用分析及数据库检索，共得到二级质谱谱图总数2 067 933个，与理论二级谱图匹配的谱图数308 807 个，肽段总数29 739 个，唯一肽段总数26 946 个，鉴定蛋白质总数3 597 个，定量蛋白数2 931 个。总体鉴定到肽段长度主要分布7～20 个氨基酸，大部分蛋白对应两个以上肽段，大部分蛋白的覆盖度在20%以下，蛋白分子量主要分布10 ～120 kD。所有样本两两之间计算Person 相关系数而绘制的热图。相应肽段、蛋白质分布情况及样本之间的相关性见图1。

图1 蛋白质鉴定与解析Fig 1 Protein identification and analysis

2.2 RhoE 敲除前后心脏组织差异蛋白筛选

以FC＞1.5、P＜0.05 作为显著上调的变化阈值，FC＜1.5、P＜0.05 为明显下调的变化标准，发现与WT_NG 组相比，WT_HG 组上调差异表达蛋白198 个，下调331 个（图2A）；KO_NG 组上调差异表达蛋白26 个，下调45 个（图2B）。与KO_NG 相比，KO_HG 上调蛋白173 个，下调255 个（图2C）。与WT_HG 相比，KO_HG 显著上调差异表达蛋白质19 个，明显下调差异表达蛋白质28 个（图2D）。相应表达最明显的前10 个蛋白质见表1。

表1 排名前10 的差异表达蛋白质列表Tab 1 Top ten differentially expressed proteins

图2 RhoE 敲除前后心脏组织的差异表达蛋白火山图Fig 2 Volcano plot of differentially expressed proteins in cardiac tissue before and after RhoE knockout

2.3 RhoE 敲除前后心脏组织差异蛋白亚细胞定位注释

WT_NG 组相比，KO_NG 组心脏组织中上调蛋白主要位于线粒体、细胞外基质、细胞核，下调蛋白主要分布于细胞质、细胞外基质、细胞核；WT_HG 组心脏组织中上调蛋白主要位于细胞质、线粒体、细胞外基质，下调蛋白主要分布于细胞质、细胞核、细胞外基质。与WT_HG 组相比，KO_HG组的心脏组织中上调蛋白主要位于细胞外基质、细胞质、线粒体，下调蛋白主要分布于细胞质、细胞核、细胞外基质。与KO_NG 组相比，KO_HG 组心脏组织中上调蛋白主要位于细胞质、细胞外基质、线粒体，下调蛋白主要分布于细胞质、线粒体、细胞核。各组间比较差异蛋白亚细胞定位注释分类图见图3。

图3 RhoE 敲除前后心脏组织差异蛋白亚细胞定位注释Fig 3 Annotation of subcellular localization of differential proteins in cardiac tissues before and after RhoE knockout

2.4 差异表达蛋白GO 注释

将筛选的差异蛋白从细胞组成，分子功能和生物过程3 个层面进行GO 注释，结果显示，与WT_NG 相比，WT_HG 组的心脏组织中上调蛋白主要分布于过氧化物酶体（peroxisome），下调蛋白主要分布于核糖体亚单位（ribosomal subunit）；上调蛋白的分子功能主要集中于共因子结合（cofactor binding），下调蛋白的分子功能主要集中于核糖体的结构成分（structural constituent of ribosome）；上调蛋白主要参与细胞脂质代谢生物过程（peroxisome organization），下调蛋白主要参与肽段生物合成 过 程（peptide biosynthetic process）（图4A、B）。与WT_NG 相比，KO_NG 组的心脏组织中上调蛋白主要分布于免疫球蛋白复合体（immunoglobulin complex），下调蛋白主要分布于细胞外区域（extracellular region）；上调蛋白的分子功能主要集中于免疫球蛋白受体结合（immunoglobulin receptor binding），下调蛋白的分子功能主要集中于细胞外基质结构成分（extracellular matrix structure constituent）；上调蛋白主要参与免疫球蛋白介导的免疫反应生物过程（immunoglobulin mediated immune response），下调蛋白主要参与氨基聚糖生物合成过程（aminoglycan biosynthetic process）（图4C、D）。与KO_NG 相比，KO_HG 组的心脏组织中上调蛋白主要分布于过氧化物酶基质（peroxisomal matrix），下调蛋白主要分布于核糖体亚单位（ribosomal subunit）；上调蛋白的分子功能主要集中于共因子结合（cofactor binding），下调蛋白的分子功能主要集中于核糖体结构成分（structural constituent of ribsome）；上调蛋白主要参与过氧化物酶组成生物过程（peroxisome organization），下调蛋白主要参与肽段生物合成过程（peptide biosynthetic process）（图4E、F）。与WT_HG 相比，KO_HG 组的心脏组织中上调蛋白主要分布于细胞外空间（extracellular region），下调蛋白主要分布于胞质大核糖体亚基（cytosolic large ribosomal subunit）；上调蛋白的分子功能主要集中于血小板衍生生长因子结合（plateletderived growth factor binding），下调蛋白的分子功能主要集中于核糖体的结构组成部分（structural constituent of ribosome）；上调蛋白主要参与血压调节生物过程（regulation of blood pressure），下调蛋白主要参与中性脂质分解生物过程（neutral lipid catabolic process）（图4G、H）。

图4 差异表达蛋白GO 注释Fig 4 GO annotation of differentially expressed proteins

2.5 差异表达蛋白KEGG 通路富集分析

将差异表达蛋白与KEGG 数据库比对后进行差异信号分析发现，与WT_NG 组相比，WT_HG 组的心脏组织中上调的信号通路主要为过氧化物酶体（rno04146 peroxisome）、细胞色素P450 对外源生物代谢的影响（rno00980 metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、花生四烯酸代谢（rno00590 arachidonic acid metabolism）等（图5A）；下调的信号通路主要有核糖体（rno03010 ribosome）、冠状病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）、蛋白质消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）等（图5B）。与WT_NG 组相比，KO_NG 组的心脏组织中上调的信号通路为rno04621 nod 样受体信号通路（rno04621 NOD-like receptor signaling pathway）（图5C）；下调的信号通路主要为蛋白质消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）、血管平滑肌收缩（rono04270 vascular smooth muscle contraction）、松弛素信号通路（rno04926 relaxin signal pathway）（图5D）等。与KO_NG 相比，KO_HG 组的心脏组织中上调的信号通路主要为萜类主链生物合成（rno00900 terpenoid backbone biosynthesis）、花生四烯酸代谢（rno00590 arachidonic acid metabolism）、过氧物酶体（peroxisome）等（图5E），下调的信号通路主要为核糖体（ribosome）、金黄色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）、冠状病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）（ 图 5F）。 与WT_HG 组相比，KO_HG 组的心脏组织中差异表达蛋白参与的上调信号通路主要为蛋白质消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption），细胞外基质受体相互作用（rno04512 ECM receptor interaction），糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号（rno04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication），下调信号通路主要为维生素消化吸收（rno04977 Vitamin digestion and absorption），脂肪消化吸收（fat digestion and absorption），胆固醇代谢（cholesterol metabolism）（图5G）。

2.6 蛋白互作网络分析

将KO_HG vs WT_HG 中显著差异表达的蛋白数据库编号或蛋白序列与STRING 蛋白网络互作数据库（V.11.0）对比分析，发现KO_HG 组与WT_HG 组相比的心脏组织上调蛋白中Col 1α1、Col 1α2 相互作用的蛋白较多，下调蛋白中参与核糖体 通 路 的 相 关 蛋 白（Rps8、Rpl7、Rpl18、Rpl23、Rpl31）在网络中的相互作用蛋白较多（图6）。

图6 蛋白互作网络分析Fig 6 Analysis of protein interaction network

3 讨论

DCM 发病机制复杂。为了解RhoE 在DCM 中的作用，本研究利用RhoE 基因编辑模式动物复制了糖尿病模型，并利用当前最新的4D 蛋白组学进行研究，以期为从全局角度剖析RhoE 与DCM 的关系。

以往利用RhoE 基因编辑细胞和动物模型揭示了许多RhoE 的在心血管系统疾病的新功能［8-11］，本研究首先委托苏州赛业公司基于CRISPR/Cas9 基因组编辑技术构建RhoE 基因敲除杂合子SD 大鼠，进一步繁育和鉴定获得了实验所需的实验动物，再应用经典的腹腔注射链脲佐菌素诱导成急性1 型糖尿病，该模型的成功复制为后续研究奠定了基础。随后分离各组大鼠心脏，采用传统的酶解法获得了满足蛋白组学所需的蛋白裂解物。通过液相色谱-质谱联用技术，分离到总的二级质谱谱图总数2 067 933 个，肽段总数29 739 个，定蛋白质总数3 597个，可定量蛋白数2 931 个。通过严格的质控，本组中肽段长度、蛋白覆盖度、蛋白分子量均符合质控要求。相关性分析表明组内样本Person 相关系数大于0.99，组间样本Person 相关系数为0.95～0.97，提示本研究所用动物组内差异很小重复性好，但组间存在显著性区别，提示送检样本符合实验要求。

在鉴定的3 597 个蛋白中，发现与WT_NG 组相比，WT_HG 组上调差异表达蛋白198 个，下调331 个，代表性的蛋白质有Cat、Ftl1、Ighm、Acot2、Pdk4、Myh6、Tuba8、Coq5、Itih2、Serpinh1 等；KO_NG 组上调差异表达蛋白26 个，下调45 个，代表性蛋白质包括Nit2、Gstz1、Ighm、Igg-2a、S100a8、Myl4、Tagln、Myh11、Mybphl、Myl7 等；与KO_NG相比，KO-HG 上调蛋白173 个，下调255 个，代表性蛋 白 质 包 括Cat、Maoa、Ftl1、Pdk4、Myl4、A1i3、Fgg、Myh6、A1m、Rps9 等；与WT_HG 相 比，KO_HG 明显上调差异表达蛋白质19 个，明显下调差异表达蛋白质28 个，代表性蛋白质包括Postn、Cacna2d2、 Ndufaf1、 Col1a1、 Col1a2、 Ighm、Lgals3bp、Plin2、Abhd16a 和Apoa4 等。亚细胞结构定位分析显示，非糖尿病状态下，RhoE 基因敲除前后蛋白分布改变最明显的是细胞骨架（cytoskeleton）、过氧化物酶体（peroxisome）和细胞核（nucleus）；早期的研究提示RhoE 有调节细胞骨架的功能［7］，本研究结果也提示RhoE 敲除后显著改变了细胞骨架蛋白的表达。此外，RhoE 敲除前后过氧化物酶体的改变也提示，其与RhoE 与氧化应激有关，这与早期的一篇报道是一致的［18］。核蛋白分布的改变提示RhoE 参与了基因表达调控。有趣的是，糖尿病态下改变最显著的分布是质膜（plasma membrane）和胞外区域（extracellular）。研究显示RhoE 表达下调促进糖尿病大鼠分泌胶原蛋白Col1a1 和Col1a2，这与胞外区域的分布改变密切相关。

差异表达蛋白GO 注释分析提示RhoE 敲除后的糖尿病大鼠主要的细胞外空间成分、相关血小板衍生生长因子结合功能、血压上调的生物过程均明显上调，而有关胞质大核糖亚基成分、核糖体结构组成功能以及中性脂质的分解的生物过程明显下调。这与先前报道的RhoE 与心血管相关研究是一致的［10］。通过KEGG 分析，本研究发现KO_NG 组与WT_NG 组相比的心脏组织中差异表达蛋白参与的信号通路主要为松弛素信号通路、黏着斑与PI3K-Akt 信号通路等。而KO_HG 组与WT_HG组相比心脏组织中差异表达蛋白参与的信号通路主要为核糖体、冠状病毒病- COVID-19 与脂肪消化吸收等。上述均提示RhoE 可能通过这些信号通路参与DCM 的病理生理过程。其中PI3K-Akt 信号通路在DCM 中至关重要，抑制PI3K/Akt 通路的自噬来改善胰岛素抵抗［19］，上调microRNA-203 可以通过PI3K/Akt 信号通路的失活靶向PIK3CA，从而 为DCM 治 疗 提 供 可 能［20］。另 外，H2 和H3 松 弛素抑制高糖诱导的新生大鼠心室肌细胞凋亡［21］，内皮细胞中高表达的核糖体蛋白（RPS4Y1）可能通过调节p38 MAPK 信号通路导致高糖诱导的功能障碍［22］。此外，脂质代谢紊乱在DCM 的发展中也起非常关键的作用，纠正脂质代谢紊乱可减轻糖尿病小鼠的心功能不全［23］。而RhoE 的缺失都会进一步导致上述信号通路的激活改变，从而对DCM 的发生发展产生影响。这为后期的进一步挖掘DCM 发病的分子机制提供了可能的方向。另一方面，最新研究表明住院的SARS-CoV-2 感染的2 型糖尿病患者会出现急性心血管综合征，而出现的急性心脏损伤相关的潜在机制仍不明确［24］。在本研究中，RhoE 缺乏的糖尿病大鼠的心脏组织中有关冠状病毒病-COVID-19 通路被富集，这似乎为COVID-19感染糖尿病患者出现急性心脏损伤的相关机制研究提供新思路。

在蛋白互作网络分析中，发现KO_HG 组与WT_HG 组相比的心脏组织上调蛋白中Col 1α1 和Col 1α2 相互作用的蛋白较多，下调蛋白中，参与核糖体通路的相关蛋白，在网络中的相互作用的蛋白较多，同样在KO_NG 组与WT_NG 组相比的心脏组织中，得到了互作的蛋白（未发表资料）。这些信息为阐明DCM 的发病机制提供更直观的实验依据。

本研究存在一定局限性。首先，本实验研究对象为RhoE 全身敲除的大鼠，并非心脏特异性敲除，因此可能对结果产生一定的影响。其次，此样本为大鼠心脏并非人类，所得结论应用人体研究尚需进一步验证。最后，富集到的相关蛋白及KEGG 信号还在验证中。

总之，本研究应用最新的4D-LQF 蛋白质组学技术，首次揭示了RhoE 表达缺失后在糖尿病心脏组织中蛋白质表达谱的变化特征，初步解析了差异表达蛋白质相关的生物学功能，富集了差异表达蛋白质参与的主要信号通路，研究结果从宏观角度上为临床上DCM 的诊断和治疗提供了一定的实验参考。

作者贡献度说明：

揭伟，郭峻莉：论文设计；伍彩霞，邹园：动物实验及样本准备；赵鋆，施凯佳，吴林栩，陈旭：数据统计、图表制作和文献检索；赵鋆，施凯佳，申志华，郭峻莉，揭伟：文稿撰写、基金获取。

所有作者声明不存在利益冲突关系。