四种FDA 批准药物抑制发热伴血小板减少综合征病毒的作用研究

王田田，尹志芸，邓雅丽，朱 琼，周 敏，胡思靖，吴巧丽，靳佳音，张丹娜，刘希佳，蒋柏勇，沈 姝，邓 菲，史君明

（1.国家病毒资源库，中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉 430071；2.南开大学药学院，天津 300071）

发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）是发热伴血小板综合征（SFTS）的病原体，属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）、白纤病毒科（Phenuiviridae）、班 大 病 毒 属（Bandavirus）［1，2］。SFTSV 感 染的主要临床症状包括发热、胃肠道症状、肌痛、局部淋巴结病、血小板减少、肝酶水平升高等，严重者可发展为多器官衰竭或死亡，其病死率为13%～30%，被世界卫生组织列为十大优先传染病之一［1，3］。目前发热伴血小板减少综合征的临床治疗主要以对症支持性治疗为主，包括：通过注射丙种球蛋白冲击治疗法（临床个案治疗有效）或激素联合免疫球蛋白（临床个案治疗有效）增强机体免疫力，以及激素冲击疗法（临床个案治疗有效）、血浆置换（临床治疗有效）等［4-6］。由于针对SFTS 尚无有效疫苗和特效药，特异性抗病毒药物的研发成为亟待解决的科学问题。

SFTSV 的基因组由3 个单链负义RNA 片段构成，分别为大片段（L）、中等片段（M）和小片段（S）。其中L 片段编码RNA 聚合酶RdRp，M 片段编码糖蛋白Gn 和Gc，S 片段编码核蛋白NP 和非结构蛋白NSs［3］。与 大 部 分 负 链RNA 病 毒 转 录 复 制 机 制 类似，SFTSV 基因组UTR 区存在保守基序，能够与RdRp 和NP 形 成RNA-蛋 白 复 合 物（RNP）负 责SFTSV 的基因复制和转录［7-9］。RNP 是SFTSV 基因复制转录最简需求，基于这一理论前期笔者成功构建了能表达eGFP 荧光蛋白的SFTSV 微复制子报告系统［10］。微复制子系统通过质粒转染细胞能够有效体现病毒RNA 的转录复制过程，启动报告基因的表达，通过读取报告基因表达水平分析病毒RNA 转录复制的效率，是研究RNA 病毒转录复制机制以及筛选特异性靶向RNA 复制过程药物的重要手段［11，12］。

迄今为止，已有研究报道过几种具有对SFTSV 抗病毒效果的药物，包括：（1）抗病毒类：广谱抗病毒药物利巴韦林（细胞实验和动物实验有效）、干扰素联合利巴韦林用药（细胞实验有效）、血浆置换联合利巴韦林（临床个案治疗有效）、法匹拉韦（动物实验有效）；（2）钙通道阻滞剂（CCBs）类：盐酸贝尼地平和硝苯地平（临床回顾性发现有效）［4］。这些药物对SFTSV 抗病毒作用的发现均是从“老药新用”的角度，通过对其他病毒具有抗病毒作用的药物针对SFTSV 抑制作用进行评估或针对临床SFTS 案例给药记录进行回顾分析而被确定。从FDA 批准药物中筛选抗SFTSV 药物能极大缩短研发周期、降低研发成本。本研究利用SFTSV微复制子系统，对FDA 批准的1 430 个化合物进行抗病毒药物筛选。进一步通过活病毒感染细胞体系对筛选获得的药物抗SFTSV 效果进行评估，并确定药物作用的具体阶段。本研究的发现将为微复制子用于SFTSV 抗病毒药物研发提供重要的理论参考，促进SFTSV 特效药的开发。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、病毒 Vero 细胞（ATCC no. CCL-81）、HEK293T（ATCC no. CRL-3216），均购于美国模式培养物集存库（ATCC），由本实验室保存；病毒 种 子 液 SFTSV（WCH/97/HN/China/2011 strain；S/M/L GenBank no.：JQ341190，JQ341189，JQ341188）来自于中国科学院武汉病毒研究所国家病毒资源库。

1.1.2 化合物 Vidofludimus、硝唑尼特、麦考酚酸、吗替麦考酚酯等1430 个FDA 批准化合物，购于Selleck 生物科技有限公司，化合物均由二甲基亚砜（DMSO）配制母液，使用时用含2 % FBS 的DEME 培养基稀释成所需浓度。

1.1.3 质粒和检测试剂 SFTSV 微复制子系统需要 的 质 粒 pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP、pCAGGs-SFTSV-RdRp 均 由 实 验 室自行构建［13］；质粒转染试剂采用Lipofectamine 3000（ThermoFisher，美国）；鼠抗SFTSV-NP 多克隆抗体为本实验室免疫制备［13］。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Vero 细胞、HEK-293T 细胞用含10% FBS 的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 病毒培养 用T-75 培养瓶培养Vero 细胞，待细胞生长量达到80% 左右弃去旧培养基并加6 mL 含2%FBS 的DMEM 培养基覆盖细胞表面，加入100 μL SFTSV WCH/97/HN/China/2011 毒 株种子液，此时MOI 约为0.1，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h ，期间每15 min 轻轻晃动培养瓶。孵育完成后补充6 mL 新鲜的含2% FBS 的DMEM培养基继续培养，5 d 后收集培养瓶中的上清于4 ℃、3 000 g/min 离心10 min，然后取上清500 μL/管分装于冻存管并-80℃保存待用。

1.2.3 病毒滴度TCID50（50% 组织培养感染剂量）测定 将Vero 细胞稀释到密度约105/mL 密度用于96 孔板铺板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。待测滴度的病毒原液用含2 % FBS的DEME 培养基进行10 倍梯度稀释，将病毒从10-1稀释至10-10，并做3 组重复，其中从10-3到10-10的病毒稀释液将用于下一步检测。将96 孔板中的旧培养基弃去，每孔加入100 μL 的病毒稀释液，每个梯度6 个复孔，共做3 组重复，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养5 d，随即通过免疫荧光检测病毒感染孔。通过观察记录每个病毒稀释梯度下产生绿色荧光的孔的数量，若孔中有荧光则记为阳性，孔中没有荧光则记为阴性，以Reed ＆ Muench 法计算出该病毒液的TCID50。

1.2.4 免疫荧光检测 弃去96 孔细胞培养板中旧培养基，每孔加100 μL 4 % 多聚甲醛，避光固定30 min；用水冲洗3 遍；随后每孔加入100 μL 0.2% Triton X-100 透化细胞15 min；用水冲洗3 遍；用PBS配制的含5%牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）封闭液于37 ℃封闭1 h 或4 ℃过夜封闭，每孔100 μL；弃掉封闭液，每孔加入100 μL 稀释好的一抗孵育液（抗体1∶2 000 稀释）37 ℃孵育2 h 或4 ℃过夜孵育；弃掉一抗稀释液，用水冲洗3 次；用含1% BSA的PBS 按1∶2 000 稀释FITC 标记的山羊抗兔血清，每孔加入100 μL 二抗稀释液37 ℃孵育1 h；弃掉二抗稀释液，用水冲洗3 次后即可使用荧光显微镜观察记录。

1.2.5 药物细胞半数毒性浓度（CC50）的确定 Vero 细胞按照细胞密度约1.0×104个/孔铺入96 孔板，每孔100 μL 体积，放入37 ℃培养箱24 h 后待细胞汇合度达到90 %左右；弃除旧培养基，将梯度稀释好的药物（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L），按照每孔100 μL 的体积加入到细胞孔中，每个药物梯度做3 个实验复孔，放在37 ℃细胞培养箱预孵育24 h；将96 孔板从培养箱中取出，按照每孔10 μL 的体系加入CCK-8 试剂，放置37 ℃细胞培养箱中继续孵育1 h；最后通过酶标仪在450 nm 处检测实验组与阴性对照组的细胞活性百分比。以药物浓度为横坐标，细胞活性百分比为纵坐标，利用GraphPad Prism 8.0. 软件绘制细胞活性的剂量依赖曲线并进行回归，计算细胞半数毒性浓度（CC50）。

1.2.6 微复制子系统上抗病毒药物的筛选 按2×105/孔将HEK-293T 细胞铺入24 孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后进行下一步 实 验 ；将 pCAGGs-SFTSV-RdRp、pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP 3 种质粒按照质量比2∶1∶1 的比例进行混合，参照Lipofectamine 3000 转染试剂说明书每孔2 μg 进行转染，37 ℃培养。将药物母液用含2% FBS 的DMEM 培养基进行2 倍梯度稀释，弃去转染6 h 后细胞培养板中的旧培养基，每孔中加入200 μL 对应浓度的药物稀释液，对照孔为仅含DMSO（药物最高浓度时所加的量）的药物稀释液，继续培养42 h。随后用高内涵分析仪进行eGFP 计数，用GraphPad Prism 8.0.1软件的非线性回归方法计算药物的半数抑制浓度。

1.2.7 活病毒体系上药物抑制SFTSV 不同感染阶段的定量分析 按每孔5×104将Vero 细胞铺入24孔板，每孔500 μL 体积，于37 ℃、5%CO2条件培养24 h 待用。用含2% FBS 的DMEM 培养基将药物稀释成所需浓度，用含2% FBS 的DMEM 培养基将病毒稀释成滴度为1×105pfu/mL，每孔加入500 μL病毒稀释液感染细胞，按照如下方式开展药物抑制实验（图1），具体包括：（1）药物作用于整个病毒感染阶段：感染前1 h 细胞培养孔中加入稀释好的药物，随后加入稀释好的SFTSV 病毒液共孵育1 h 后弃去旧培养基，换新的含有药物的培养基继续培养；（2）药物作用于病毒感染前：稀释好的药物与病毒液共孵育1 h 后感染细胞，且病毒与细胞孵育1 h后换上不含药物的培养基继续培养；（3）药物作用于病毒入侵阶段：病毒与药物同时加到细胞培养孔孵育1 h 后弃去旧培养基换上新的不含药物培养基继续培养；（4）药物作用于病毒入侵后阶段：病毒感染细胞1 h 后弃去旧的培养基，随后换上含有药物的培养基继续培养。细胞培养23 h 后，弃掉孔中旧培养基，用无菌PBS 润洗3 遍，每孔加入400 μL Trizol 作用5 min 后，用移液器吹打混匀并吸取到1.5 mL EP 管中，进行后续的RNA 提取和绝对定量分析。

图1 药物抑制SFTSV 不同感染阶段的给药流程图Fig 1 Flowchart of drug administration in different stages of SFTSV infection

RT-qPCR 定量检测SFTSV 所用引物为HEX染料标记的序列：HEX-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ-2，检测试剂盒为HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（诺唯赞，南京，中国）。

2 结果

2.1 药物细胞半数毒性浓度（CC50）

使用CCK-8 法检测了候选的4 种药物对细胞活性的影响，结果显示各作用浓度时，细胞活性仍大于80 %，回归分析显示各药物的CC50均＞100 μmol/L（表1）。因而进一步在＜100 μmol/L 的浓度范围内研究药物对病毒感染的抑制效果并确定药物的IC50。

表1 4 种候选药物的细胞半数毒性浓度（CC50）Tab 1 Median cytotoxic concentration（CC50）of four drug candidates

2.2 微复制子系统上抗病毒药物的筛选

通过高内涵扫描分析1 430 个FDA 批准药物对SFTSV 微复制子的影响，共筛选出4 种能起显著抑制作用的药物，分别为吗替麦考酚酯、麦考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus。药物梯度抑制实验表明随着药物浓度的增高，药物对SFTSV 的抑制效果逐渐增强，表现出强的剂量相关性（图2）。计算分析显示吗替麦考酚酯、麦考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 种药物在微复制子系统上的半数抑制浓度分别为0.014、0.627、1.283、0.059 μmol/L。结合药物的CC50，各药物的治疗指数（TI）均＞10，表明这些药物安全性高（表2）。

图2 微基因组系统上4 种药物不同浓度下对SFTSV 的抑制作用Fig 2 Inhibition of SFTSV by the four drugs at different concentrations on the mini-replicon system

表2 微基因组系统上4 种药物不同浓度下对SFTSV 的抑制效果和安全性Tab 2 Inhibitory effect and safety of the four drugs at different concentrations to SFTSV infection

2.3 活病毒体系上4 种药物抑制SFTSV 不同感染阶段的定量分析

为进一步确定药物对病毒感染的作用阶段，本研究在细胞水平开展了4 种不同的给药方式：药物全程作用于SFTSV（entire stage）、药物作用于SFTSV 感 染 前（virion stability）、药 物 作 用 于SFTSV 感 染 入 侵 时（entry stage）、药 物 作 用 于SFTSV 入侵细胞后（post-entry）。结果如图3 和表2 所示：药物全程作用于SFTSV 时，4 种药物在3 种浓度下对SFTSV 均有显著抑制效果；用药物对SFTSV 进行预处理时，4 种药物对SFTSV 增值不起抑制作用；药物作用于SFTSV 入侵细胞时，只有吗替麦考酚酯在较高浓度下对SFTSV 有若的抑制效果，其余3 种药物对SFTSV 没有抑制效果（图3A）；当药物作用于SFTSV 入侵细胞后阶段，4 种药物对SFTSV 的增值抑制效果显著，值得注意的是Vidofludimus 在3 种浓度下对SFTSV 的抑制效果均达到99% 以上。综合结果表明4 种药物对SFTSV的抑制作用主要发生在SFTSV入侵细胞后。

图3 4 种药物在SFTSV 感染细胞不同阶段的抑制效果Fig 3 Inhibitory effects of the four drugs on SFTSV infected cells at different stages

表3 4 种药物在SFTSV 感染细胞不同阶段的抑制效果统计分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

表3 4 种药物在SFTSV 感染细胞不同阶段的抑制效果统计分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

实验组t/P给药方式整个阶段入侵前入侵时入侵后整个阶段入侵前入侵时入侵后整个阶段药物对照组吗替麦考酚酯麦考酚酸硝唑尼特20 μmol/L 6.535±0.080 8.900±0.050 7.190±0.100 5.870±0.229 6.663±0.276 8.664±0.130 7.326±0.096 5.623±0.136 7.341±0.054 5 μmol/L vs.Vehicle 6.425/0.003 0.7265/0.500 1.876/0.133 3.972/0.057 13.100/0.000 1.463/0.217 0.735/0.503 4.222/0.014 0.598/0.582 10 μmol/L vs.Vehicle 13.83/0.000 2 1.210/0.292 0.350/0.743 4.463/0.047 7.19/0.002 2.046/0.110 0.708/0.518 3.076/0.037 2.397/0.075 20 μmol/L vs.Vehicle 5.034/0.007 5.984/0.004 3.837/0.019 4.971/0.038 5.953/0.004 1.632/0.178 2.739/0.052 4.965/0.008 12.160/0.000入侵前6.686±0.127 7.352/0.002 0.032/0.976 0.332/0.756 Vidofludiums入侵时入侵后整个阶段入侵前入侵时入侵后8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.367±0.194 8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.122±0.269 8.707±0.098 6.736±0.080,n=3 6.814±0.149 6.874±0.182 8.568±0.091 7.141±0.297 7.216±0.175 7.464±0.136 5 μmol/L 6.042±0.125 8.565±0.176 7.357±0.134 6.590±0.015 6.535±0.081 8.580±0.084 7.560±0.077 5.728±0.191 8.629±0.086 6.14±0.011,n=3 6.191±0.292 7.227±0.046 6.294±0.080 7.254±0.086 7.595±0.088 4.980±0.149 10 μmol/L 6.454±0.38 8.539±0.068 7.610±0.013 6.471±0.048 7.113±0.142 8.573±0.038 7.563±0.076 5.743±0.358 8.470±0.011 6.742±0.164,n=3 7.008±0.120 6.800±0.172 5.671±0.133 7.126±0.115 7.433±0.025 4.563±0.096 6.951±0.228 6.261±0.062 5.742±0.250 7.017±0.185 7.647±0.042 4.774±0.013 1.898/0.131 1.878/0.123 18.610/＜0.0001 0.363/0.735 1.926/0.127 12.28/0.000 1.011/0.369 0.293/0.784 17.910/＜0.0001 0.049/0.963 1.220/0.290 17.37/＜0.0001 0.500/0.644 3.185/0.033 10.580/0.001 0.355/0.740 2.381/0.076 19.670/＜0.0001

3 讨论

SFTSV 流行范围不断扩大，除中国至少15 个省，韩国、日本和越南等其他亚洲国家也陆续报道了该病，SFTSV 已严重威胁人类公共健康［14］。研发有效的抗SFTSV 药物成为急需解决的科学问题。本研究通过微复制子系统对FDA 批准的1 430个化合物进行抗SFTSV 药物筛选，结果表明吗替麦考酚酯、麦考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 种药物对SFTSV 具有抑制作用，同时4 种药物中硝唑尼特、Vidofludimus 具有较好的剂量依赖性，随着浓度的升高对SFTSV 的抑制效果增强。活病毒感染细胞模型检测结果显示这4 种药物均能明显降低SFTSV 的拷贝数，能有效抑制活病毒感染；通过在SFTSV 感染过程的不同阶段给药，进一步确定这4种药物主要作用于SFTSV 入侵细胞后的阶段，与微复制子系统检测结果一致。微复制子系统能够有效体现病毒基因组的转录复制效率，通过该系统进行药物筛选更能有效精准的靶向病毒的转录复制过程。因此，利用微复制子是不涉及活病毒操作筛选抗RNA 病毒药物的重要且安全的手段。

本研究筛选鉴定的对SFTSV 具有抑制作用的4 种药物的临床应用与抗病毒并不相关。吗替麦考酚酯［15］和麦考酚酸［16］是一种非竞争性、可逆的次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶抑制剂，具有强大的抑制淋巴细胞增殖的作用，主要用于移植术的免疫排斥治疗。基于SFTSV 微复制子系统的测试结果显示吗替麦考酚酯的IC50值最小，在较低的浓度下对SFTSV 具有良好的抑制效果，提示吗替麦考酚酯是一种潜在的有效抗SFTSV 药物。而这类次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶抑制剂的药物是否具有抗RNA病毒广谱性值得深入探究。硝唑尼特是一种人工合成的硝噻柳酸酰胺的衍生物，主要用于抗原虫、抗肠道寄生虫［17］，也有一些研究报道该药物具有好的抗病毒效果，例如抗犬流感病毒（IC50为0.17～0.21 μmol/L），同时表现出对HBV 和HCV 复制的有效抑制［18］。本研究结果进一步提示硝唑尼特的抗病毒效应可能具有广谱性。Vidofludimus 是一种口服的二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorate dehydrogenase，DHODH）抑制剂，是一种免疫抑制剂。尽管目前几乎还没有针对该化合物用于抗病毒研究的报道，但该化合物的新一代衍生物Vidofludimus calcium（又被称为IMU-838）可用于治疗一种自身免疫性疾病肌萎缩性脊髓侧索硬化症，并已进入二期临床实验；该衍生物对新冠病毒SARS-CoV-2、人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency type 1，HIV-1）有抑制作用［15，19-21］，提示该药物可能具有广谱的抗病毒作用及潜在应用价值。

解析药物、宿主、病毒之间的复杂关系和作用机制是发现抗病毒作用新靶点，筛选抗病毒药物的重要理论基础。本研究从“老药新用”的角度，基于微复制子和病毒感染细胞模型筛选出具有良好的抗SFTSV 效果的4 种药物，提示“老药新用”是快速获得有效抗病毒药物的重要手段。

作者贡献度说明：

孙鑫：课题主持人，论文撰写者，完成主要的实验设计，并参与实验造模取材及指标检测等相关工作。王田田、沈姝、邓菲、史君明：实验设计；王田田、尹志芸、朱琼、邓雅丽：实验主要实施；周敏、靳佳音、胡思靖、张丹娜：负责实验研究涉及细胞、试剂耗材；刘希佳、蒋柏勇、吴巧丽：抗体制备；王田田：文章执笔；沈姝、邓菲、史君明：文章审阅和修订。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

［本文编辑］ 邹 洲 宋睿璞 朱 昊