基于网络药理学探讨补益调经合剂 防治宫腔粘连的作用机制

张永青，余惠，季晓黎

（成都中医药大学，四川 成都 610072）

0 引言

宫腔粘连也被称为Asherman综合征，其由妊娠或其他因素引起的子宫损伤，导致的子宫内膜基底层受损，引起子宫内膜纤维化和宫腔粘连及变形[1]。其临床症状主要为月经量减少或闭经、不孕及流产，对患者的心理健康和生育功能造成严重影响[2,3]。宫腔镜为目前治疗宫腔粘连的首选治疗方式[4]，是目前治疗IUA的主要手段，宫腔镜下粘连分离术主要分为电切和冷刀。电切术是临床广泛应用的技术手段，它能有效分离粘连组织，但其电热量容易损伤子宫内膜，术后容易复粘[5,6,7,8]。因此，如何预防宫腔粘连分离术后再粘连的发生，解决患者月经过少及妊娠需求是目前临床的难题也是亟需解决的问题之一。

补益调经合剂是成都中医药大学附属医院院内制剂，全方以肝肾同调为指导共奏补肾益精、益气养血、调经助孕之效。现代动物实验研究[9]及大量临床实例观察[10]表明补益调经合剂防治宫腔粘连分粘术后继发月经过少、改善妇女的生殖功能有确切的疗效，但其具体机制尚未明了。本研究欲利用网络药理学方法，从整体出发，系统性地探讨补益调经合剂治疗IUA的潜在机制，以期为扩大本方在临床的应用并进一步行科学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 补益调经合剂化学成分和靶点筛选

登录TCMSP[11]依次输入补益调经合剂组方成分,如“党参”，以生物利用度(OB)＞30%且类药性(DL)＞0.18为条件,筛选出补益调经合剂中利用度及活性偏高的有效活性成分。应用通用蛋白质数据库(UniProt)[12]，将获得的药物活性成分靶标进行通用名称注释。

1.2 宫腔粘连相关靶点筛选

通过 GeneCards、OMIM数据库，输入关键词 “Intrauterine adhesions”，收集IUA相关靶点，整理后建立IUA相关靶点数据集。

1.3 补益调经合剂活性成分靶标与宫腔粘连共同作用靶标的获取

运用Venny2.1软件绘制补益调经合剂活性成分与宫腔粘连相关靶标得到韦恩图，该图中相交集靶标，就是二者共同作用靶标。

1.4 PPI网络的构建

将通过韦恩图取交集得到的补益调经合剂活性成分靶标与宫腔粘连共同作用靶标上传至STRING[13]数据库,物种设为”Homo sapiens”，将“minimum required interaction score”设为“highest confidence(0.900)”，其余参数保持默认设置。即可得到靶标蛋白互作网络图，导出其TSV格式图片。

1.5 中药-成分-靶点网络构建

将PPI 网络图导入 Cytoscape3.7.2[14]软件，构建“中药-成分-靶点网络”图，药物活性成分和作用靶点 以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。按照链接靶标数量降序排列，链接的靶点数越多表明与该靶点作用就越大[15]。由此筛选出的关键靶点可作为接下来分子对接的对象。

1.6 GO和KEGG富集分析

借助R语言利用Bioconductor[16]软件，将补益调经合剂有效活性成分与IUA共同作用的靶点进行GO和KEGG通路富集分析，并可视化。

1.7 分子对接验证

将1.5中得到的关键靶点输入PDB[17]数据库，下载关键靶点的3D蛋白质结构，导入PyMol 2.3.4软件[18]对关键蛋白进行处理后，保存后导入 Autodock 4.2.6 软件[19]再次进行处理。在 TCMSP 数据库中下载对接成分，保存为“mol2”结构，利用 Autodock 进行核心成分的分子对接。

2 结果

2.1 补益调经合剂活性化学成分和相关靶点

借助TCMSP数据库,最终筛选出补益调经合剂组方的活性成分2056个，去除重复项后剩余252个，按OB大小降序排列，选取前15个有效活性成分。

2.2 IUA靶点基因筛选

通过 GeneCards、OMIM数据库检索到IUA相关靶点3246个。

2.3 补益调经合剂对IUA作用靶点筛选

将去除重复项后的252个补益调经合剂活性成份靶标与IUA相关靶标 3246个靶点取交集，得到151个交集基因，交集基因的 Venn 图（见图 1）。

图1 补益调经合剂-IUA 交集基因 Venn 图

2.4 PPI网络图

登录STRING数据库，将通过韦恩图取交集得到的补益调经合剂活性成分靶标与宫腔粘连共同作用靶标上传，得到靶标蛋白互作网络图（如图2）。

图2 共同作用靶标蛋白互作网络

2.5 中药-成分-靶点网络构建及分析

将PPI 网络图导入Cytoscape3.7.2软件，构建图3。其中最外圈节点代表二者共同作用靶标，内圈节点代表活性成分，节点之间的连线代表二者的互作关系。按照链接靶标数量降序排列，补益调经合剂治疗IUA前4位的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇；同理可得补益调经合剂治疗IUA作用的前6位主要靶标为MAPK1、RELA、STAT3、JUN、EGFR、MMP9。

图3 补益调经合剂治疗宫腔粘连活性成分-共同靶标互作网络

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路的富集分析

借助R语言利用Bioconductor软件，得到GO分析结果，选取前20位以气泡图(见图4)形式进行可视化。由图可见补益调经合剂治疗IUA主要参与nuclear receptor activity、ligand-activated transcription factor activity、cytokine activity等多方面的生物过程。同理得到KEGG分析结果(见图5)，可见补益调经合剂治疗IUA作用的通路有Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。

图4 补益调经合剂治疗宫腔粘连的前20位GO功能富集分析结果

图5 补益调经合剂治疗宫腔粘连的前20位KEGG通路富集分析结果

2.7 分子对接结果

为讨论网络预测的准确性，我们在网络图中选取degree较高的前4个成分包括槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇作为对接药效成分，选取dgree较高的靶点MAPK1、STAT3、VEGFA、JUN作为对接靶点通过Autodock 4.2.6软件分别进行分子对接。据相关文献报道，结合能小于-5.0 kcal/mol 是分子对接时配体和受体稳定结合的标准，结合能越低分子结构稳定性越高[20]，亲和力越强。如表2所示，成分与靶点均具有一定的亲和力，其中木樨草素与STAT3结合具有良好稳定性，槲皮素与STAT3有良好的稳定性，其余大多数药效成分能与对接靶点构成氢键增强稳定性。对上述对接结果利用 PyMol 2.3.4软件绘图(图6)，以上分子对接结果表明，槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇成分是补益调经合剂治疗宫腔粘连的潜在活性成分，可能通过MAPK1、STAT3、VEGFA、JUN这些靶点发挥作用。

表2 核心活性化合物与核心蛋白最低结合能（单位：kcal/mol）

图6 蛋白对接构象

3 讨论

宫腔镜宫腔粘连分离术(TCRA)是目前治疗本病主要方法，术后一般为促进子宫内膜修复多采用雌激素治疗以期恢复月经，但雌激素治疗作用的发挥必须是建立在有足够残留内膜的基础之上，若宫腔粘连的程度较重、子宫内膜损伤的面积较大，即便是术后使用雌激素也是很难促进子宫内膜再生修复，恢复月经和生育能力，预防再粘连，达到有效的治疗效果[21]。

中医实则无“宫腔粘连”这一病名的记载，现依其主要临床表现将其归属于“经水过少”“不孕”等范畴。中医学认为肾在女子的经、带、胎、产中担任着不可取代的作用，正如《傅青主女科》载：“经本于肾”。本病多起于流产刀刃创伤，损耗肾精，冲任血海空虚，气血运行不畅，瘀血阻络故“肾虚血瘀”为该病最主要病机。补益调经合剂是成都中医药大学附属医院院内制剂，以参芪圣愈五子汤为基础组方旨在补气健脾、益精养血调经[22]。将我院妇科门诊就诊的108例宫腔粘连分粘术后月经过少患者，随机分为两组，治疗组为补益调经合剂组，对照组为四物合剂组，两组治疗后总有效率分别为87.0%、70.4%，且两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。该临床观察表明，补益调经合剂治疗宫腔粘连分粘术后月经过少安全可靠且疗效确切。但针对宫腔粘连患者宫腔分粘术后反复粘连，补益调经合剂如何弥补子宫内膜修复困难、改善月经过少症状具体过程的这一难题，成为了亟待研究清楚的问题。

通过网络药理学分析表明补益调经合剂防治IUA是一个多成分、多靶点、多通路的综合过程。筛选得到补益调经合剂排名靠前的有效成分包括槲皮素、木樨草素、山奈酚、β-谷固醇。现代研究也表明，槲皮素可恢复Treg/Th17的平衡从而带有抗炎和调节免疫的作用[23]。β-谷甾醇通过降低促炎因子和环氧化酶COX-2的水平，也具备一定的抗炎作用[24]。山奈酚的抗炎活性在体内和体外均有发挥。一些研究表明山奈酚通过抑制核因子 NF-κB活性从而抑制促炎细胞因子、趋化因子和酶的表达。木樨草素通过在体外分别通过抑制信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT3)来降低炎症反应[25]。IL-17信号通路多通过介导炎性因子的趋化、脱颗粒以及细胞内包涵趋化因子受体的粘着分子(称为整合素)的活性变化，涵盖许多信号级联反应(如MAP激酶途径)积极参与炎症反应[26]。大量研究表明，氧化应激在与女性生殖健康相关的妇科疾病如不孕症、反复流产等的发生发展过程扮演着不可或缺的角色[27]。NF-κB参与氧化应激、炎症和细胞因子刺激等多种细胞生理过程，是细胞内重要的核转录因子[28]。研究表明，IUA 患者子宫内膜组织中 NF-κB 表达水平明显偏高，这也在一定程度上证明其与子宫粘连的发生和程度具有相关性[29]。

补益调经合剂治疗宫腔粘连可能通过槲皮素、木樨草素等多化学活性成分，作用于MAPK1、STAT3、VEGFA、MMP9、JUN及 IL-17通路和TNF等信号通路转导，进而调控nuclear receptor activity、ligandactivated transcription factor activity、cytokine activity等生物过程，通过 Lipid and atherosclerosis、Fluid shear stress and atherosclerosis、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、高级糖化终产物及其受体(AGE-RAGE)、低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)等信号通路发挥抗炎、抗氧化、抑制新生血管生成、促进多种胶原及非胶原成分降解抗纤维化而防治IUA。表明补益调经合剂在防治IUA的过程中具有多成分、多靶点、多通路的优势，为日后宫腔分粘术后及时使用中医药介入治疗，促进子宫内膜修复，改善月经过少及妊娠结局提供了有效的理论指导。