基于网络药理学和分子对接探讨桃仁——红花药对治疗缺血性脑卒中潜在机制

李平，夏文广，郑婵娟，段璨，李正良 ，曹钰卓，张荷玲

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430000；2.湖北省中西医结合医院，湖北 武汉 430000；3.湖北省直属机关医院，湖北 武汉 430000）

0 引言

脑卒中是世界范围内致死、致残的主要原因之一，缺血性脑卒中是最常见的类型，约占60%～80%[1]。中医将缺血性脑卒中归属于“中风”范畴，以益气活血化瘀为主要治疗方法[2]。红花-桃仁药对是活血化瘀的经典药对，始于元代王好古所著《医垒元戎》中的加味四物汤[3]。近年来桃仁、红花在脑血管病中应用广泛，但分子层面的作用机制尚不清楚，本研究通过网络药理学与分子对接技术预测桃仁-红花药对治疗缺血性脑卒中的作用靶点与信号通路，为该药对治疗脑卒中提供临床应用依据，并对中药的研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 桃仁-红花活性成分和靶点筛选

通过TCMSP平台（Traditional Chinese Medicine Systerms Pharmacology）收集桃仁、红花所有活性成分[4]，以口服利用度(OB)＞30%，类药性(DL)＞0.18为标准[5]筛选活性成分。通过挖掘文献补充被遗漏的活性成分。使用UniProt 数据库得到活性成分相关靶点并对靶点进行规范化。

1.2 缺血性脑卒中相关靶点筛选

通过OMIM、GeneCards、TTD和DrugBank[6]数据库得到缺血性脑卒中相关靶点。利用BioinfoGP中VENNY2.1工具，将药物活性成分的预测靶点与疾病相关靶点进行交集分析并绘制韦恩图，提取活性成分与疾病的交集靶点。

1.3 蛋白质互作网络图构建

将1.2中的交集靶点，导入STRING平台绘制得到PPT（protein-protein interaction network）网络图和tsv文件。通过Cytoscape 3.7.2软件中的CytoNCA包对PPI进行网络拓扑学分析，进一步评估关键靶点并绘制网络图，利用CytoHubba插件计算度值≥19的Hub基因。

1.4 GO和KEGG分析

将交集靶点通过DAVID数据库进行GO(Geneontology)富集分析和 KEGG( Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 通路分析（人种设定为人）。

1.5 “活性成分-靶点-通路”网络的构建

将药对与疾病的活性成分-靶点-通路整理成Network文件和Type文件，上传到Cytoscape 3.7.2，构建活性成分-靶点-通路网络图，分析网络拓扑参数。

1.6 分子对接

对“活性成分-靶点-通路”网络中度值排名靠前的靶点与活性成分进行分子对接验证。通过 Pubchem 数据库下载活性成分SDF格式文件，通过OpenBabel（version 2.4.1）转换为MOL2格式；通过PDB数据库下载PDB格式的靶点蛋白晶体结构。利用AutoDock Tools对结构进行去水、加氢等处理，通过AutoDock Vina进行分子对接，最后用Pymol软件绘制分子对接示意图。

2 结果

2.1 桃仁-红花药对中活性成分的筛选

TCMSP 数据库检索得到桃仁成分66个，红花成分189个，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共得到桃仁红花活性成分各17个，查询相关文献[7]进行补充，去除重复值最终获得34个潜在活性化合物，结果见表1。

表1 桃仁-红花中的活性化合物

2.2 缺血性脑卒中相关靶点的筛选

共得到缺血性脑卒中相关靶点1202个，药物成分靶点与疾病相关靶点交集韦恩图如图1所示，缺血性脑卒中与桃仁共有靶点32个，缺血性脑卒中与红花共有靶点147个，缺血性脑卒中、桃仁、红花潜在靶点总数为149个。

图1 桃仁和红花药对与缺血性脑卒中靶点的韦恩图

2.3 缺血性脑卒中与桃仁和红花药对共有靶点的 PPI 网络及分析

通过STRING平台得到缺血性脑卒中与桃仁和红花药对共有靶点的PPI网络（见图2），共有98个节点、2240条边。根据度中心性[8](Degree Centrality，DC)＞19进一步确定关键靶点。按Degree值由大到小排序，统计出频次前20的Hub基因并绘制条形图（见图3）横坐标为靶点的度值。其中IL-6、ALB、AKT1、TNF、VEGFA度值显著高于其余交集靶点，在PPI 网络中起着重要的联系作用。AKT1度值最大，可能是药对治疗缺血性脑卒中最主要的潜在靶点。

图2 桃仁-红花药对治疗缺血性脑卒中的关键靶点PPI网络

图3 前20个互作靶点

2.4 GO和KEGG分析

通过DAVID数据库对交集靶基因进行GO富集分析及 KEGG 通路分析。使用微生信平台对结果进行可视化处理。

GO富集分析包括BP(biological process)629条结果，CC（cellular component)74条结果，MF(molecular function) 148条结果，根据P值＜0.01从小到大排列，均选取前 20 条进行富集分析（图4）。

图4 共有靶点的GO生物学过程富集分析

KEGG富集分析涉及121条信号通路，根据P值＜0.01，FDR值＜0.05作为筛选条件，从小到大排列，选取前20条通路绘制气泡图（图5）。

图5 共有靶点的前20条 KEGG通路

2.5 “活性成分-核心靶点-通路”网络的构建

“活性成分-核心靶点-通路”网络如图6所示，选择KEGG 富集中Count值前10的信号通路，集中展示桃仁-红花药对作用靶点的所在通路。34个主要活性成分可能通过作用于149个靶点，在10条信号通路中发挥作用，表明桃仁和红花药对可能通过多成分、多靶点、多通路抑制脑卒中的发生发展。

图6 “活性成分-核心靶点-通路”网络

2.6 分子对接技术预测川芎-赤芍药对活性成分与潜在靶点的结合能力

对Degre e值排名前十的核心活性成分与Degree值排名前五的关键靶点进行结合能力预测。一般认为小于-5.0kcal/mol有较好的结合活性，小于-7.0kcal/mol有强烈的结合活性[9]。结果发现β-谷固醇、羟基红花黄色素A、木犀草素、山奈酚、赫达拉汀赤霉素7与ALB、AKT1和VEGFA有强烈的结合能力，见表2。通过PyMOL软件对部分成分与靶点对接结果进行可视化，见图7。

表2 核心活性成分与核心靶点结合能预测

图7 核心活性成分与核心靶点对接结果

3 讨论

本研究收集桃仁红花药对活性成分34个，通过网络药理学研究发现，桃仁-红花药对中活性成分度值最高的是槲皮素、豆淄醇、羟基红花黄色素A、木犀草素、山奈酚等。研究表明这些化合物具有抗炎抗氧化、抑制细胞凋亡，改善微循环、保护血脑屏障，改善脑水肿和神经功能缺损等作用[10-13]。拓 扑分析和PPI网络图表明，ALB、IL-6、AKT1、TNF和VEGFA是桃仁-红花治疗缺血性脑卒中的关键靶点。研究发现血清白蛋白（ALB）[14]、白介素-6（IL-6）[15]在缺血性脑卒中后炎症发生、发展过程中起着重要作用，肿瘤坏死因子（TNF）对细胞间黏附分子1的表达具有调节作用，可引发血管炎性，并诱导炎性细胞从血管内转移至神经组织[16]，VEGFA可以促进血管生成，恢复缺血区的血液供应，起到保护神经元、减轻脑缺血损伤的作用[17]。GO富集结果分析表明，桃仁红花治疗缺血性脑血管病可能与氧化应激的反应、活性氧代谢、细胞凋亡调控等有关。研究[18]表明这些生物过程与神经系统的功能密切相关，参与了脑缺血的病理生理过程。KEGG富集结果提示TNF 信号通路、细胞凋亡通路、HIF-1 信号通路，PI3K-Akt 信号通路被显著性富集，是桃仁-红花治疗缺血性脑卒中的主要通路。TNF信号通路可以介导血管内皮细胞上粘附分子的表达，促进中性粒细胞浸润，影响血脑屏障通透性[19]。HIF-1信号通路在急性脑缺血时被激活，介导HIF-1α表达。相关研究表明，PI3K-Akt信号通路的激活与抑制与脑梗死有密切联系[20]，特别是对脑缺血再灌注后氧化反应、血管生成、细胞凋亡等过程[21]及改善脑缺血再灌注损伤有重要作用[22-23]。分子对接结果显示关键靶点与活性成分对接效果好，其中AKT1、ALB、VEGFA与10种主要活性成分的结合能均≤-7.0kcal/mol，表明有较强结合活性。由此推测关键靶点与主要成分结合可能是桃仁红花发挥治疗缺血性脑卒中的关键。

综上所述，桃仁红花主要通过槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于AKT1、ALB、VEGFA、IL-6、ALB等关键靶点，调节炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和血管新生等作用，进而调控细胞凋亡通路、 HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3-K/Akt信号通路等通路治疗缺血性脑卒中。该结果为桃仁-红花治疗缺血性脑卒中作用机制提供理论指导。为2020湖北省科技重大专项基于湖北道地药材的现代中药创制技术提升提供参考。该药对的剂量是否对治疗效果有影响是我们下一步需要研究的问题。