黄曲霉毒素检测方法的研究进展

2022-12-16袁京磊

现代食品 2022年1期

◎ 袁京磊

（平邑县检验检测中心，山东平邑 273300）

黄曲霉毒素（AFT）主要是由黄曲霉、寄生曲霉等霉菌产生的一类化学结构类似的毒性代谢产物，它们广泛存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别容易污染花生、玉米、稻米等粮食，是霉菌毒素中毒性最大的一类霉菌毒素[1]。最常见的6种AFT分别是黄曲霉毒素 B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1）和 M2（AFM2），其中AFB1的急性毒性、致癌性、致突变性、致畸性在所有的真菌毒素中均居首位。AFT是目前发现的较强的致癌物质，主要诱发肝癌，严重威胁人类的健康。防止AFT污染的策略主要有防霉、去毒（物理去及化学去除法、生物脱毒方法）和检测，其中对食品中AFT进行检测是防止AFT中毒的重要一环，也是保障食品安全的重要措施。

1 高效液相色谱法

目前，国标法主要使用高效液相色谱（HPLC）对食品中的AFT进行检测，其原理是将试样中的AFT提取后，再经净化柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质，再经液相色谱分离、荧光检测器检测、外标法定量等步骤，实现对AFT准确的检测。姚誉阳等[2]建立了QuEChERS-HPLC-柱后光化学衍生法测定粮谷类食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的分析方法；样品经过1%甲酸-乙腈提取，MgSO4+C18+PSA净化，HPLC-柱后光化学衍生化法检测，AFB1、AFG1和AFB2、AFG2线性范围分别为 0.5 ～ 20 μg·L-1、0.125 ～ 5 μg·L-1，检出限为0.1 ～ 0.3 μg·kg-1，定量限为 0.3 ～ 1.0 μg·kg-1，加标回收率为86.4%～97.8%，相对标准偏差（RSD）为2.9%～6.3%，该方法可用于粮谷类食品中AFT的大批量检测。刘颖等[3]建立了同步检测饲料中AFB1、玉米赤霉烯酮（ZEN）及呕吐毒素的高效液相色谱法；样品用乙腈-水提取，过三合一免疫亲和柱净化，用甲醇洗脱，洗脱液经50 ℃浓缩氮气吹干后用50%甲醇-水复溶，采用HPLC串联光化学衍生器、荧光检测器和紫外检测器进行检测；其中，检测AFB1标准品的线性范围为2.5～50.0 ng·mL-1，平均加标回收率为81.2%～92.3%，RSD为4.3%～9.5%；该方法具有准确度和精密度高、稳定性好的特点，可用于饲料中AFB1、ZEN及呕吐毒素的同步检测。

2 可视化检测方法

可视化检测方法能够直观地观察到检测结果，无需借助复杂的仪器设备，具有简单、快速、结果可视化等优势。目前，已有应用可视化检测方法实现AFT检测的报道。ABNOUS等[4]基于CRISPR-Cas12a、滚环放大和纳米金的催化活性，建立了高灵敏度检测AFM1的比色适配体传感器；在AFM1存在的情况下，CRISPR-Cas12a会失活，添加T4 DNA连接酶和phi29 DNA聚合酶后，纳米金表面会形成大的单链DNA结构；因此，加入4-硝基苯酚后，颜色仍为黄色；当不存在AFM1时，由于CRISPR-Cas12a激活和引物消失，纳米金表面没有形成大的DNA结构，样品的颜色变为无色；该方法对AFM1具有高选择性，检测限（LOD）低至0.05 ng·L-1，并成功用于牛奶样品中AFM1的检测。TANG等[5]设计了一种使用智能手机读取比色信号的快速检测AFB1的纸基微流控芯片，实现了对AFB1的可视化检测，该方法的LOD和定量限分别为9.4 ng·mL-1、12.00 ng·mL-1。

3 电化学检测方法

电化学检测方法在食品安全检测中有着广泛的应用，能够实现对食品中有害成分高灵敏、准确的检测。近年来，随着适配体研究的深入，基于适配体和电化学的新型检测方法在AFT检测中的应用越来越多。惠媛媛等[6]基于还原氧化石墨烯（RGO）构建了用于AFM1检测的电化学适配体传感器；采用红枣汁还原氧化石墨烯（GO）制备RGO，通过滴涂法将RGO修饰在玻碳电极（GCE）表面，利用电沉积法将纳米金修饰在RGO/GCE上，AFM1的适配体（Apt）通过Au-S键固定在AuNPs/RGO/GCE电极表面用于靶标AFM1的捕获；当AFM1存在时，AFM1与适配体特异性结合形成AFM1-Apt复合物，该复合物阻碍了电子的传递，导致电化学信号减弱，该方法的检测范围为1×10-7～ 5×10-4ng·mL-1，LOD为 3.3×10-5pg·mL-1。GUO等[7]基于聚4-乙烯基吡啶、碳化钛和羧化氧化石墨烯复合材料构建了一种用于检测AFB1的独特开/关转换电化学适配体传感器，用于检测酸性环境中的AFB1，该方法具有较宽的检测范围（0.01～50 ng·mL-1）和较低的LOD（3 pg·mL-1）。SINGH等[8]设计了一种基于氧化锰纳米粒子的电化学免疫传感器，实现了对AFB1的检测；使用电泳技术在氧化铟锡表面上覆盖了一层氧化锰纳米粒子薄膜，用来固定AFB1抗体，再用差分脉冲伏安法选择性检测AFB1；检测范围为1 ～ 10 μg·mL-1，LOD为 0.54 pg·mL-1；对玉米提取物进行加标回收实验，回收率为98.6%。

4 荧光分析法

荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法，荧光分析法在AFT的检测中应用也较多。JIANG等[9]构建了双色持续发光纳米传感器，用于同时和无自发荧光测定AFB1和ZON；通过制备功能性双色持续发光纳米粒子与Fe3O4磁性纳米粒子，并使用具有高亲和力和特异性的适配体作为识别工具，实现对食品样品中AFB1和ZON的高灵敏度和选择性检测，LOD分别为0.29 pg·mL-1和0.22 pg·mL-1，加标回收率分别为93.6%～103.2%和94.7%～105.1%。QIAO等[10]基于AFM1/适配体复合物导致荧光信号变化的原理，设计了一种快速、简单检测牛奶中AFM1的方法；首先，将AFM1的适配体用羧基荧光素修饰，它的互补DNA（cDNA）用羧基四甲基罗丹明淬灭基团修饰；在没有AFM1的情况下，适配体与cDNA杂交，由于适配体的荧光团靠近cDNA上的淬灭基团，导致适配体荧光淬灭；当AFM1存在的情况下，AFM1适配体复合物的形成诱导了适配体的结构转换，导致cDNA释放，从而产生荧光信号；该方法的线性响应范围为1～100 ng·mL-1，LOD为0.5 ng·mL-1；对牛奶样品进行加标回收实验，回收率为93.4%～101.3%。

5 酶联免疫吸附测定方法

酶联免疫吸附测定（ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，在疾病诊断和食品安全检测中有广泛的应用。张宁等[11]结合间接竞争反应机制，运用ELISA方法建立了快速检测AFT的改进方法，该方法的半抑制浓度（IC50）＜ 0.1 μg·L-1，加标回收率为 67% ～ 116 %，灵敏度达到0.03 μg·L-1。WANG等[12]建立了一种间接竞争性ELISA方法，用于快速检测地甲虫、蟑螂、蚕和蚯蚓中的AFB1；该方法的IC50为0.092～0.135 ng·mL-1，LOD为0.008～0.020 ng·mL-1；对实际样品进行检测，检测结果与液相色谱结合串联质谱检测的结果具有良好的相关性。YAN等[13]基于生物素化纳米抗体Nb26和链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶设计了一种生物素-链霉亲和素扩增的ELISA方法，用于灵敏、快速地检测谷物中的AFB1；该方法的IC50值为0.21 ng·mL-1，检测时间为50 min，可节省多达98%的抗体；应用该方法检测两种谷物样品中的AFB1，检测结果与HPLC的结果基本一致。

6 其他检测方法

除以上检测方法外，其他检测AFT的方法主要有生物传感器、免疫传感器及荧光共振能量转移（FRET）、试纸条等，均能实现对AFT的快速、准确检测。HAMAMI等[14]设计了防污PEG/纳米金复合物的生物传感器，实现了对牛奶中AFM1的灵敏检测，检测范围为 20 ～ 300 pg·mL-1，LOD低至 7.14 pg·mL-1。LI等[15]开发了一种超灵敏检测牛奶中AFM1残留的免疫传感器；LOD为 0.018 6 ng·mL-1（18.10 ng·kg-1），线性范围为0.003～0.81 ng·mL-1，对牛奶样品进行加标回收实验，平均回收率为79.6%～112.5%，RSD为6.7%～13.3%。WU等[16]基于FRET构建了一种用于检测AFB1的新型上转换纳米材料适配体传感器；线性范围为 0.2 ～ 500 ng·mL-1，LOD为 0.028 ng·mL-1；该方法对花生油和小麦样品进行加标检测的精密度和准确度与HPLC没有明显差异。LI等[17]开发了一种基于时间分辨荧光微球免疫层析试纸条，用于快速定量检测牛奶及其制品中的AFM1；该试纸条的线性范围为 0.05 ～ 2.0 ng·mL-1，IC50为 0.204 ng·mL-1，灵敏度为0.019 ng·mL-1，加标回收率为84.6%～119.0%；检测牛奶样品中AFM1的结果与超高效液相色谱-串联质谱的结果基本一致，可用于定量检测牛奶中的AFM1。