贵州岩溶山区白三叶根际高效溶磷菌的筛选

韦 鑫， 舒健虹*， 曾庆飞， 李亚娇， 张礼维

(1. 贵州省草业研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.黔西南州农业农村发展中心， 贵州 兴义 562400)

0 引言

【研究意义】磷元素是植物细胞的重要组成部分，对植物细胞的生长和增殖有重要作用，且参与植物光合作用、糖和淀粉利用等活动，在植物能量代谢和物质运输活动中扮演重要角色[1-2]。植物缺磷时，会表现出生长延缓、矮小瘦弱、叶色发暗易脱落、根系发育不良等现象，影响农产品品质。植物主要通过根部的磷转运蛋白从土壤中吸收磷元素，能被植物吸收的通常是无机磷酸盐，即H2PO4-和HPO42-磷酸盐离子[3-4]。而磷酸盐离子易与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等离子形成难溶性的磷酸盐，很难直接被植物吸收利用[5-6]。有研究报道，土壤中95%以上的磷为植物难以直接利用的无效磷[7]，我国约有75%的土壤缺磷[8]。化学磷肥的使用可以在短期内显著增加土壤有效磷含量，但其中的有效磷很快会被土壤中的化合物和粘粒吸附和沉淀，从而变成植物难以直接利用的形态。研究显示，化学磷肥当季的利用率不到30%，甚至会更低[9]。化学磷肥的大量使用，不仅增加农民投资成本，还会造成生态环境污染。因此，土壤溶磷菌的开发与利用，是安全有效开发土壤磷库资源的方式之一。【前人研究进展】根际溶磷菌(Phosphate solubilizing bacteria, PSB)作为有益微生物在植物根际土壤中广泛存在，其可通过产生有机酸和酶，把土壤中不能被植物利用的无机或有机磷转化为植物可利用的有效磷，促进植物磷素的供应和生长[10]。朱颖[11]从三叶草根际中分离获得既能溶解有机磷又能溶解无机磷的溶磷菌株。李显刚[12]从百脉根和白三叶根际分离的溶磷菌株，对百脉根及白三叶有促生作用。蔡璐等[13]从白三叶根际获得溶磷能力较强的菌株，且菌株对植物生物量提升促进效果明显。程宇阳[14]从苹果园白三叶根际分离的溶磷菌株，不仅能促进白三叶的生长，还能增加土壤中有效磷含量。【研究切入点】目前报道的溶磷菌种类和数量较多，但针对白三叶根际溶磷菌的研究报道不多。白三叶作为世界上分布最广的牧草之一，在畜牧业中占有重要地位，也是贵州省分布较为广泛的一种天然野生豆科牧草。从野生白三叶根际分离筛选具有溶磷能力的菌株，发掘适用于本地农业生产的根际溶磷菌，丰富不同植物根际溶磷菌的研究。【拟解决的关键问题】采集贵州省境内不同生境的白三叶根际土壤，从中分离、纯化出溶磷细菌并进行分子鉴定，利用培养液溶磷量测定，筛选出贵州岩溶山区环境中溶磷能力强的高效溶磷菌株，为植物根际溶磷菌的开发利用和生态农业发展提供资源材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品 从贵州省黔南、黔东南、六盘水和毕节地区不同生境的岩溶山区，按照5点取样法采集白三叶健康植株根系及附着的根际土壤，常规方法混合后装入无菌封口袋中，带回实验室4℃冰箱保存。共采集白三叶根系和根际土壤7份，土壤采集地信息见表1。

表1 土壤采集地的生境信息

1.1.2 培养基 PKO(Pikovaskaia,s)无机磷培养基[15]：Ca3(PO4)23.0 g，酵母粉0.5 g， (NH4)2SO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，FeSO4·7H2O 0.003 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，固体培养基用于溶磷菌株的分离筛选，液体培养基用于菌株溶磷能力测定。LB(Luria-Bertani)培养基[16]：牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，用于菌株的活化及菌种保存。

1.2 试验方法

1.2.1 白三叶根际溶磷菌的分离 采用PKO(Pikovaskaia,s)无机磷培养基分离和筛选根际溶磷菌。取20 g牧草根际土壤(带根系)，放入无菌研钵中加少量水进行研磨后，采用平板稀释法进行溶磷菌的分离，将土壤悬液按比例稀释到10-6～10-4后分别涂布到PKO平板上，28℃培养7 d，观察平板上菌落生长及菌落周围培养基透明圈变化情况，挑选培养基透明圈比较明显的菌落进行纯化培养，观察菌株在PKO培养基上的形态特征。使用LB培养基进行菌株扩繁，菌株使用25%的甘油，存于2 mL冻存管内，放于―20℃冰箱中保存。

1.2.2 溶磷菌株的鉴定 将获得的溶磷菌株在PKO平板上培养5 d后，送往北京擎科生物科技有限公司昆明测序部进行16S rRNA基因序列测定，使用通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。将菌株基因序列在NCBI网站上进行BLAST序列比对，寻找相似菌株，对菌株进行初步分类鉴定。

1.2.3 高效溶磷菌株的筛选 挑取菌株长势较好的单菌落，在LB培养基中扩繁培养5 d，取0.5 mL菌悬液接种到50 mL PKO液体培养基中，接入等量无菌水作对照(CK)，每个菌株设置3个重复，28℃、150 r/min振荡培养7 d，得到菌株培养液。培养液pH测定：使用pH计(PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)进行培养液测定；菌株溶磷量测定：将菌株培养液10 000 r/min、4℃离心15 min，取1 mL上清液，钼锑抗比色法测定菌株溶磷量[17]。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 白三叶根际土壤溶磷菌菌株的菌落特征及分子鉴定

从表2可看出白三叶根际土壤溶磷菌的菌落特征和菌株分子鉴定结果。

表2 溶磷菌菌株的菌落特征与分子鉴定

2.1.1 菌落特征 白三叶根际土壤(PD4、PD5、PD6、PD14、PD17、PD18和PD21)中分离出有溶磷性的菌株14株。菌株在PKO培养基上多为淡黄色、黄色、乳白色、淡褐色的光滑湿润的圆形或不规则形菌落。

2.1.2 分子鉴定 分离的14株溶磷菌株中有10个菌株属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)，2株属于肠杆菌属(Enterobactersp.)，1株属于泛菌属(Pantoeasp.)。PD21-5在NCBI网站上blast结果显示与uncultured bacterium(登录号：EU881114.1)相似性为99.63%，仅根据16S rRNA基因序列分析，暂时无法进行分类地位判断。

2.2 白三叶根际土壤溶磷菌株的溶磷量及其与培养液pH的相关性

2.2.1 溶磷量 由表3可知，白三叶根际土壤溶磷菌株的溶磷能力有较大差异，14株菌株的溶磷量在41.96～239.84 μg/mL。其中，PD6-10菌株溶磷量最高，达239.84 μg/mL；PD6-9菌株其次，为230.40 μg/mL，两者均极显著高于其他菌株；PD4-5菌株第三位，为210.48 ug/mL，极显著高于除PD6-10和PD6-9外的其他菌株；PD4-1和PD4-11菌株也相对较高，分别为164.06 μg/mL和160.87 μg/mL，极显著高于除上述菌株外的其余菌株。总体看，溶磷量居前三位的菌株分别是PD6-10、PD6-9和PD4-5，溶磷量在210.48～239.84 μg/mL，属高效溶磷菌株。

表3 白三叶根际土壤溶磷菌株的溶磷量

2.2.2 溶磷量与菌株培养液pH的相关性 培养7 d后，菌株培养液pH与对照相比均有所下降，菌株PD6-9、PD6-10和PD4-5的培养液pH较低，分别为4.04、4.22和4.23，与其他菌株差异显著。通过菌株培养液pH与溶磷量的相关性分析，二者之间呈极显著负相关关系(P<0.01)。

3 讨论

不同土壤不同环境中溶磷菌的数量存在很大差异[18]。本研究从野生白三叶根际土壤(PD4、PD5、PD6、PD14、PD17、PD18和PD21)中共分离出14株溶磷细菌，其中从PD4土样(新成土)中分离出溶磷菌株4株，分离占比最高，为28.57%。经过16S rRNA基因序列比对，初步鉴定分离获得的溶磷菌属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)、肠杆菌属(Enterobactersp.)和泛菌属(Pantoeasp.)均属已见报道的溶磷菌种类[14]。

溶磷菌株在固体培养基上，溶磷能力受产生有机酸种类和分子扩散能力的影响[19]，所以采用液体培养基进行定量分析其溶磷能力更科学合理[20-21]。研究结果表明，高效溶磷菌PD6-10、PD6-9和PD4-5的溶磷量为210.48～239.84 μg/mL，在相同培养条件和培养时间下，高效溶磷菌溶磷量高于李显刚[12]的研究结果，低于程宇阳[14]的研究结果，菌株溶磷量的高低也受磷源和培养条件的影响。

溶磷菌的溶磷量与培养液pH之间的相关关系在不同的研究中结论不一，杨慧等[22]认为，溶磷量与pH之间没有相关性；但NIJKAMP等[23-25]研究显示，溶磷细菌通过产酸从而获得溶磷能力，认可度较高的溶磷机理是菌株产生有机酸，通过羟基与难溶性磷酸盐上的金属离子螯合，使难溶性磷转变为可溶性磷[26]。该研究中细菌溶磷量与培养液pH呈极显著负相关关系，说明从野生白三叶根际分离出的溶磷菌溶磷能力与细菌产酸密切相关，与部分研究者的研究结论一致。溶磷菌有多种溶磷机理，产酸是其中的一种，更多种类的溶磷机理有待进一步研究。

4 结论

从贵州省不同生境采集的7份白三叶根际土壤样品中筛选出根际溶磷菌14株，菌株在PKO培养基上为淡黄色和乳白色光滑湿润的圆形或不规则形菌落。从中筛选出高效溶磷菌株3株，编号为PD4-5、PD6-9和PD6-10，均属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)，其溶磷量分别为210.48 ug/mL、230.40 ug/mL和239.84 ug/mL，其培养液pH分别为4.23、4.04和4.22，菌株溶磷量与培养液pH呈极显著负相关关系。