云南红河州番茄褐色皱纹果病毒检测

吴 阔， 陈永对， 王田田， 吴少政， 朱若萌， 张仲凯

(云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室， 云南昆明 650205)

0 引言

【研究意义】番茄是云南高原农业特色蔬菜，也是云南省主要外销蔬菜之一。病毒病是番茄的主要病害，及时检测明确病原，有利于病毒病的有效防控，为番茄产业可持续发展提供保障。【前人研究进展】番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBFRV)属于Virgaviridae烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，基因组为单链正RNA，病毒粒子杆状，长约300 nm, 直径约18 nm，可经无性繁殖、种子及接触等方式传播，引起叶片系统花叶、斑驳，果实褐色斑、有皱纹，是番茄和辣椒的毁灭性病害。该病毒在约旦番茄果实上首次报道[1]，后传播至以色列、意大利、巴勒斯坦、墨西哥、荷兰等亚洲、美洲、欧洲的国家和地区[2-5]，2019年在我国山东番茄上发现[6-8]，2021年在云南元谋番茄上发现[9]。番茄受该病毒感染后能够引起植株系统发病，造成减产30%～70%。【研究切入点】从感病的番茄果实入手，探索番茄褐色皱纹果病毒快速检测技术，通过形态学、细胞生物学、血清学和分子生物学手段检测该病毒，以达到快速精准的目的。【拟解决的关键问题】2021年6月在云南省红河州蒙自市发现番茄果实表面褐色斑块且果实表面皱缩不光滑的病样，为明确引起云南红河番茄褐色皱纹果病原，建立病毒检测技术，为预防该病毒传播和治疗提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

感病番茄(SolanumlycopersicumL.)于2021年6月采自云南省红河州蒙自市，共采集7个番茄果实样品，其症状表现为果实表面褐色斑块，果实表面皱缩不光滑，样品编号记录为21YV151～21YV157。

1.2 方法

1.2.1 病毒形态学和细胞病理学检测 将番茄果实(21YV151)的褐色病斑部位用刀片切下，切碎，加1～2滴ddH2O混匀，用镀有聚醋酸甲基乙烯酯(Formvar)膜的铜网吸附3 min，用吸水纸吸去余液，待膜略干，用2%钼酸铵(pH 5.5)染色3 min，吸去余液，晾干后在FEITECNAIG2Spirit型透射电子显微镜下观察病毒粒体形态。

将21YV151病果表皮切成1 mm×2 mm小片，经3%戊二醛固定，用0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗，再用1%锇酸固定2 h，用0.2 mol/L磷酸缓冲液漂洗后，乙醇按照30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%系列脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，在FEITECNAIG2Spirit型透射电镜下观察切片。

将采集的7个番茄果实用粉碎机打碎，提取病毒粒子[10]，作负染色在FEITECNAIG2 Spirit型透射电镜下观察切片。

1.2.2 间接ELISA检测 用浙江大学吴建祥课题组提供的烟草花叶病毒属(Tobamovirus) 病毒抗体即黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic viurs，CGMMV)、齿兰环斑病毒(Odontoglussum ring spot virus，ORSV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)以及购自Agdia的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)进行ELISA检测(酶联免疫吸附剂测定)，抗体详情见表1。检测方法参见文献[10]，即将番茄果实研磨在磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后将样品上清液加入96孔酶标板中，每孔加入100 μL样品溶液(抗原)，37℃孵育3 h，用洗板机(Biotech)清洗酶标板，用含有2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液于4℃封闭过夜。第2天分别加入一抗和酶标抗体，各孵育1.5 h，加底物于室温显色30 min，根据酶标仪读数的数值大小，判断病毒含量。

表1 ELISA检测用植物病毒抗体

1.2.3 病毒分子生物学方法鉴定 引物参照文献[2]设计，反转录起始引物为ToBRFV特异性下游引物， PCR扩增引物为番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)特异性引物ToBRFV -F (5′-AAT GTC CAT GTTTGTTACGCC-3′)和ToBRFV -R( 5′-CGAATGTGATTTAAAACTGTGAAT-3′)，扩增片段位置为小复制酶亚基区，该引物只能扩增ToBRFV，不能扩增烟草花叶病毒属其他病毒，预期产物约560 bp。采用Progema总RNA提取试剂盒，参照说明书进行。以提取的病叶总RNA为模板，用逆转录试剂盒(Promega)，以随机引物为起始引物反转录合成第一链cDNA；以第一链cDNA为模板，ToBRFV-F和ToBRFV-R为引物进行PCR扩增，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环；最后72℃延长10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。用胶回收法纯化目的PCR产物，与pGEM-T Easy (Progema)载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在加入氨苄青霉素的麦康凯琼脂平板上，37℃培养16 h，用一步法RT-PCR试剂盒进行菌落RT-PCR鉴定阳性克隆，送测序公司测定序列。用NCBI的BLASTn进行同源性检索。

2 结果与分析

2.1 病毒的形态学和细胞病理学特征

感病番茄果实表皮呈褐色斑块等典型褐色皱纹果的症状(图1A)。番茄果实经负染后电镜观察，可观察到杆状的病毒粒体，长度约300 nm、直径约18 nm，具有典型的烟草花叶病毒属病毒的粒子特征(图1B)。感病果实的细胞超微结构显示，杆状病毒粒子散布于细胞质内(图1C)，叶绿体膜较完整，其中聚集大量病毒粒子，感病果实细胞为典型的Tobamovirus细胞病理特征(图1D)。

注：A为典型褐色皱纹果的症状，B为负染后电镜观察病毒粒体，C为细胞质内散布病毒粒子，D为叶绿体中聚集大量病毒粒子。

2.2 病毒与TMV和ToMV的血清学相关性

经ELISA检测发现，5个感病番茄果实样品病毒与TMV的多克隆抗体呈阳性反应，3个感病番茄果实样品病毒与ToMV单克隆抗体呈阳性反应，所有感病番茄果实样品病毒均与CGMMV、ORSV、TSWV单克隆抗体无血清学反应(表2)。说明，该病毒与Tobamovirus的TMV和ToMV具有血清学相关性。

表2 番茄果实的血清学反应

2.3 PCR产物克隆及序列测定

从感病番茄果实分离物中提取总RNA，用番茄褐色皱纹果病毒特异性引物进行RT-PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约560 bp的特异片段(图2)，与引物设计预期结果一致。将回收的特异性片段进行克隆、筛选，得到7个阳性克隆，经序列测定，阳性克隆序列一致，插入片段全长为560 bp，用NCBI的BLASTn进行同源性搜索，该序列与番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)的南美洲分离物(GeneBank：MW314111.1)的同源性最高，为99.81%。因此判断，在云南红河州蒙自市发现的番茄果实褐色斑块由番茄褐色皱纹果病毒侵染。

注：M为marker 2000，1为阴性对照，2为21YV151，3为21YV152，4为21YV153，5为21YV154，6为21YV155，7为21YV156，8为21YV157，9为阳性对照。

3 讨论

番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)是通过种子传播的新型烟草花叶病毒属病毒[11]，2014年在中东地区首先发现。近年在我国也有报道，2021年4月被农业农村部列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。2021年6月在云南省红河州蒙自市发现番茄果实表面褐色斑块且果实表面皱缩不光滑的病样，从症状看，番茄病样与国内外报道ToBRFV侵染的番茄具有相似症状，疑似由ToBRFV引起。通过电子显微镜观察发现，病毒粒子呈约300 nm×18 nm的杆状形态，具有烟草花叶病毒的病毒粒子特征；病毒粒子中间有核酸线，病毒粒子散布于细胞质中，在叶绿体中有规律排列[12]，其病理学特征与TMV相似。

ELISA检测发现，采集的7个感病番茄果实样品中有5个样品与烟草花叶病毒属的TMV多克隆抗体呈阳性反应，3个样品与ToMV单克隆抗体呈阳性反应，但与同病毒属的ORSV、CGMMV的单克隆抗体无血清学反应，推测引起云南红河州番茄果实褐色皱纹症状的病毒可能为烟草花叶病毒属病毒，基于RT-PCR特异性扩增的病毒部分基因序列分析，进一步证实该病毒是ToBRFV。

红河州是云南省冬早蔬菜番茄、辣椒的主要种植区，因此，对番茄等作物种子和种苗进行种植前检测，是预防该病毒入侵至关重要的环节，可从根本上遏制该病毒的传播为害[13]。

4 结论

通过病害症状、病毒粒子形态和细胞病理学特征、ELISA检测及部分基因序列测序对云南红河州番茄褐色皱果病的病原检测，电子显微镜观察到病毒粒子为长300 nm、直径18 nm的杆状病毒，ELISA检测发现与烟草花叶病毒属的烟草花叶病毒(TMV)和番茄花叶病毒(ToMV)有血清学反应；RT-PCR扩增获得的目的片段与番茄褐色皱纹果病毒的病毒基因相似性达99.81%。因此判断，引起云南红河州番茄褐色皱纹果病的病毒是烟草花叶病毒属的番茄褐色皱果病毒。ToBRFV与同属病毒具有血清相关性，也具有抗原特异性。因此，ToBRFV的血清检测技术需要制备特异的单克隆抗体，以避免检测时因同属病毒的血清相关性而出现诊断错误。