黑枸杞油脂肪酸和生育酚的分析

周琪乐，罗诗萌，高园，冯天威，方雪砚，崔东影，解庆刚

（1.北京市营养源研究所，北京 100069；2.北京市丰台区疾病预防控制中心，北京 100071；3.黑龙江飞鹤乳业有限公司，北京 100015）

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）是茄科（Soicnaceae）枸杞属（Lycium）多年生落叶植物的成熟果实[1-2]，与宁夏枸杞（Lycium barbarum）和黄枸杞（Lycium chinense）同属我国原有的7种枸杞品种[3]。黑枸杞含有多种营养成分和生物活性物质，如糖、氨基酸、精油、类胡萝卜素、维生素、脂肪酸和矿物质，以及类黄酮、多酚类和花青素等[4-6]，被用于治疗各种疾病，包括心脏病、视力模糊、咳嗽、哮喘、糖尿病、肾衰竭、不育和神经疲劳等[7-9]。黑枸杞具有保健功能且药用价值高，再加上其风味独特，作为一种超级水果也越来越受欢迎[10-11]。随着需求的日益增长，黑枸杞在我国青海、新疆和甘肃等地区被广泛种植。

近年来，由于人们对食用油的广泛需求，开发新资源食用油逐渐引起人们关注，从果蔬和茶叶等作物种子中提取的油脂可以作为替代植物油的候选[12-14]。枸杞油中含有丰富的不饱和脂肪酸、植物甾醇和生育酚等营养成分[15]，与牛油果籽油、菠萝蜜籽油、木瓜籽油、石榴籽油、南瓜籽油、茶叶籽油、葫芦籽油、椰子油、牡丹籽油和橄榄油一样具有降低血脂和胆固醇、抗氧化、调节免疫、预防动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的保健功能[16-17]，显示出重要的经济价值和广阔的应用前景。

枸杞果实中的种籽经漂洗分离后可用于提取天然植物油脂。目前，枸杞油的提取方法主要有超临界CO2流体萃取法、直接压榨法、水代法和有机溶剂萃取法等[18]。将枸杞加工生产过程中分离出的副产品枸杞籽和果渣，采用超临界CO2萃取技术萃取，可以得到纯天然、高浓度及具备高效生理活性的枸杞油[19-21]。从枸杞中提取的籽油成分对人体有许多潜在的功效作用，人们也越来越关注枸杞的开发。然而其在加工中产生的食品工业材料会造成环境污染，因此，将它们转化为有价值的油脂，提高枸杞资源的利用效率，并减少残留物，保证充分、高效发挥枸杞功效作用是必要的。黑枸杞和红枸杞从果实形态、大小、颜色和植物化学成分等方面有明显差别[1-3，9-10]。目前，对红枸杞油加工工艺和化学成分的研究有较多报道[18-20]，但有关黑枸杞油的化学成分和生物活性的研究相对较少。

本研究旨在分析黑枸杞油中具有营养价值和生物活性的脂肪酸和生育酚，并与不同加工方式得到的黑枸杞油、红枸杞油和其它新资源植物油进行比较。本研究对于不同产地和不同类型枸杞加工副产物的合理利用和推广具有一定指导意义，也可为枸杞资源的持续和深度利用提供参考，对推动枸杞产业链高质量发展具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑枸杞油：青海晶珠藏药高新技术产业集团。

盐酸、氨水、乙醚、石油醚（沸程30℃～60℃）、乙醇（95%）、氯化钠、硫酸氢钠、氢氧化钾（均为分析纯）：北京化工厂有限责任公司；焦性没食子酸（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、无水硫酸钠（分析纯）：上海易恩化学技术有限公司；正庚烷、异辛烷（色谱纯）：天津光复精细化工有限公司；甲醇（色谱纯）：德国EMD Millipore公司；三氟化硼甲醇溶液（浓度为15%）：美国Sigma-Aldrich公司；十一碳酸甘油三酯、混合脂肪酸甲酯标准品、单个脂肪酸甲酯标准品：北京中检航标计量技术有限公司；α-生育酚（＞99.0%）、β-生育酚（＞99.0%）、γ-生育酚（＞99.0%）和 δ-生育酚（＞99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；其它试剂均为分析纯；试验用水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

Shimadzu GC-2010 Plus气相色谱仪（配置氢火焰离子化检测器）、SHIMAZSU UV-2550紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Hitachi L-2000型高效液相色谱仪（配置紫外检测器）：日本日立公司；Sartorius CP225D电子分析天平：德国赛多利斯公司；METTlER TOLEDO ME204E/02分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 试验方法

1.2.1 脂肪酸的组成和含量分析

参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》中的样品处理方法对黑枸杞油中的脂肪酸进行甲酯化并配制脂肪酸标准溶液。向黑枸杞油试样中加入内标物后进行皂化和脂肪酸甲酯化反应，反应完成后经极性毛细管柱气相色谱分析，采用内标法定量测定脂肪酸甲酯含量。准确称取黑枸杞油0.5 g，再加入2.0 mL十一碳酸甘油三酯内标溶液、100 mg焦性没食子酸、2 mL 95%乙醇和4 mL水，混匀。加入2%氢氧化钠甲醇溶液8mL，在80℃水浴上回流，直至油滴消失。之后从冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液继续回流2 min。之后迅速冷却至室温25℃，加入10 mL～30 mL正庚烷，振摇2 min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液5 mL，加入3 g～5 g无水硫酸钠，振摇、静置，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

气相色谱测定条件：SP2560毛细管色谱柱（100m×0.25 mm×0.2 μm）。进样器温度270℃，检测器温度280℃，程序升温条件为初始温度100℃，持续13 min；100℃～180℃，升温速率10℃/min，保持6 min；180℃～200℃，升温速率1℃/min，保持20 min；200℃～230℃，升温速率4℃/min，保持15.5 min。载气为氮气，流速为1.0 mL/min，分流比为 10 ∶1，进样体积：1.0 μL。

动脉粥样硬化指数（atherogenic index，AI）和易氧化性值（oxidisability value，Cox）分别参考 Ulbricht等[22]和Fatemi等[23]的方法进行计算。AI值和Cox值的计算公式如下[24]。

式中：单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）；多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）。

1.2.2 维生素E的组成和含量测定

参照GB 5009.82—2016《食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》中的样品处理方法配制维生素E标准系列溶液，并对黑枸杞油样品中的维生素E进行皂化、提取、净化、浓缩后，经反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。称取50 g黑枸杞油，加入30 mL无水乙醇、5 mL 10%抗坏血酸溶液、0.1 g 2，6-二叔丁基对甲基苯酚混匀，加入0.5%氢氧化钾溶液10 mL，边加边振摇，混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30 min，结束后冷却至室温25℃。将皂化液转至分液漏斗中并加入50 mL乙醚，振荡萃取5 min，静置分层后下层溶液加入50 mL混合醚液再次萃取，合并醚层。水洗醚层直至中性，去除水相。醚层经无水硫酸钠滤入旋转蒸发瓶，于40℃水浴中减压蒸馏至近干。用甲醇将蒸发瓶内残留物溶解于5 mL容量瓶定容，溶液过0.22 μm有机系滤膜后，采用高效液相色谱测定。平行测定3次，结果取平均值。

液相色谱条件：Security Guard ODS C18（10 μm，4 mm×3.0 mm）预柱，SHISEIDO CAPCELL PAK C18分析柱（5 μm，150 mm×4.6 mm），柱温 38℃，流动相为甲醇 ∶水（98∶2，体积比），流速 1 mL/min，检测波长为300 nm，进样量 20 μL。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 20.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞油脂肪酸的组成和含量分析测定结果

脂肪酸组成和含量是确定油脂营养价值的重要指标。黑枸杞油的脂肪酸组成和含量见表1。

表1 黑枸杞油的脂肪酸组成和含量Table 1 Fatty acid composition and lipid indices of Lycium ruthenicum Murr.seed oil

续表1 黑枸杞油的脂肪酸组成和含量Continue table 1 Fatty acid composition and lipid indices of Lycium ruthenicum Murr.seed oil

由表1可知，黑枸杞油共含有20种脂肪酸（fatty acids，FAs），其中，SFA 和 UFA 10种，MUFA 和 PUFA 10 种，含量分别为 10.00、88.70、20.70、67.90 g/100 g。显然，被作为加工副产品的黑枸杞种子和果皮中也含有高浓度的FAs。

MUFA 和 PUFA（C16：1n7+C17：1n7+C18：1n9c+C20：1+C24：1n9+C18：2n6c+C18：3n6+C18：3n3+C20：2+C20：5n3）、UFA 和 SFA（C14：0+C15：0+C16：0+C17：0+C18：0+C20：0+C21：0+C22：0+C23：0+C24：0）占总脂肪酸的含量分别为21.0%、68.8%、89.9%和10.15%。含量最高的脂肪酸依次为亚油酸（C18：2n6c）、油酸（C18：1n9c）、α-亚麻酸（C18：3n3）、棕榈酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0），含量分别为 53.70、20.20、12.00、6.26 g/100 g和2.56 g/100 g，这些脂肪酸占总脂肪酸的96%，而3种含量较高的UFA占总脂肪酸的87%，两种含量较高的SFA占总脂肪酸的8.9%。黑枸杞油含n-6系列脂肪酸2种（亚油酸和γ-亚麻酸），含量为55.78 g/100 g；含n-3系列脂肪酸2种（α-亚麻酸和顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸），含量为 12.10 g/100 g；n-6和n-3二者之和占总脂肪酸的68.80%。n-6系列中以亚油酸为主，n-3系列中以α-亚麻酸为主，这两种必需脂肪酸分别占总脂肪酸的54.4%和12.2%，占不饱和脂肪酸的60.6%和13.5%。

PUFA具有抗炎、抗癌、抗肥胖、预防和治疗心脑血管疾病、调节人体脂质代谢、预防和改善老年痴呆等功能[25]。MUFA中油酸含量最高，占总脂肪酸含量的20.4%，油酸只有一个双键，这种成分在橄榄油中的含量达70%以上，所以相比其它植物油，橄榄油更不容易氧化[16]。

多不饱和脂肪酸中亚油酸和α-亚麻酸是维持机体功能不可缺少、但机体不能合成、必须由食物提供的必需脂肪酸[26]。亚油酸含量最高，占总脂肪酸含量的54.4%。n-6系亚油酸在人体内能转变为γ-亚麻酸和花生四烯酸（arachidonic acid，AA），AA（C20：4n6）也是一种n-6多不饱和脂肪酸。在某种意义上γ-亚麻酸和AA也是必需脂肪酸。AA是人体大脑和视神经发育的重要物质，对提高智力和增强视敏度具有重要作用。由于人体一般不缺乏亚油酸，而更容易容易缺乏α-亚麻酸，因此含量高达12.00 g/100 g的黑枸杞油也是α-亚麻酸的良好来源。α-亚麻酸是所有n-3多不饱和脂肪酸的前体物质[26]，可在人体内转化为二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），具有抗动脉粥样硬化和抗炎作用以及神经元保护功能，有助于预防痴呆[25]，有益于预防和治疗癌症、心脑血管病、糖尿病、类风湿病、皮炎症、抑郁症、精神分裂症、老年痴呆症、过敏、哮喘、肾病和慢性肺炎等[12，21，25-26]。

PUFA和SFA的比值（PUFA/SFA值）低于0.45被认为是不可取的。黑枸杞油PUFA/SFA值为6.78，远大于0.45，说明其可以有效降低血清胆固醇和动脉粥样硬化以及预防心脏病，黑枸杞油是具备较大开发价值的健康油脂。另外，黑枸杞油的AI值和Cox值分别为0.10和0.88均较低，显示出脂肪酸的潜在健康效应[24]。

Ili'c等[24]认为，尽管脂肪酸谱相似，但不同枸杞果实中各脂肪酸的相对百分比存在明显差异，导致不同枸杞果实的SFA、MUFA和PUFA含量不同；枸杞中亚油酸含量超过50%，枸杞中SFA含量最高的是棕榈酸，其次是硬脂酸，这与本文研究结果基本一致。

2.2 不同方法提取的枸杞油的脂肪酸组成和含量

黑枸杞油以其特有的FAs为特征。表2列出了文献报道的不同方法提取的枸杞油的脂肪酸组成和含量[15，20-21]。

表2 不同方法提取的枸杞油的脂肪酸组成和含量Table 2 Fatty acid composition and content of goji berry seed oil extracted by different methods g/100 g

由表2可知，直接压榨法生产的黑枸杞油中含有13种脂肪酸[15]，Zhao等[21]采用超临界CO2萃取技术得到的黑枸杞油检测到16种脂肪酸。显然，超临界CO2萃取法制备的黑枸杞油试样中脂肪酸的组成更丰富。这说明利用超临界CO2作萃取剂，从黑枸杞加工副产物果皮籽粒这类液体/固体物料中萃取、分离和纯化有效成分，可减少生理活性物质的损失，特别适合热敏性物质、易氧化物质和挥发性物质的分离提取。相比直接压榨法，超临界CO2萃取法提取的黑枸杞油α-亚麻酸的含量更高，棕榈酸和油酸的含量略高，亚油酸含量略低，其它脂肪酸含量差异不明显；与本试验样本所含20种脂肪酸比较，两种超临界CO2萃取技术得到的油脂有16种相同的脂肪酸，本试验黑枸杞油样本中亚油酸和γ-亚麻酸含量略低，而油酸含量略高，并且含有高达11.80 g/100 g的α-亚麻酸。因此推测这两种黑枸杞油脂肪酸组成和含量的差异可能源于超临界CO2萃取条件的不同以及黑枸杞来源的不同。另外，黑枸杞油相比红枸杞油含有更多的脂肪酸成分，说明黑枸杞油是一种亚油酸和亚麻酸含量较为丰富的高品质新资源植物油。表3列出了8种不同植物油[27]和8种新资源籽油[12]的脂肪酸含量。

由表3可知，除葵花籽油外，黑枸杞油亚油酸含量高于所有植物油和新资源籽油；除胡麻油和紫苏籽油外，黑枸杞油亚麻酸含量高于其它植物油和新资源籽油；黑枸杞油中油酸含量与大豆油、葵花籽油、胡麻油、紫苏籽油和南瓜籽油接近；SFA中黑枸杞油棕榈酸仅高于青花菜籽油、紫苏籽油和石榴籽油，硬脂酸含量低于大豆油、花生油、葵花籽油、芝麻油、菠萝籽油、木瓜籽油、释迦果籽油、甜樱桃种子和南瓜籽油。

表3 不同植物油和新资源籽油的脂肪酸含量比较Table 3 Comparison of fatty acid content between different vegetable oils and new seed oils %

2.3 黑枸杞油抗氧化成分生育酚的含量分析

生育酚即维生素E，是一种人体必需的脂溶性维生素，也是一种优良的抗氧化剂和营养剂，在坚果、水果、蔬菜及粮食等作物中均存在。天然存在的维生素E有4 种生育酚（tocopherol，TP），即 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。其中α-生育酚生理活性最高。生育酚具有多种生物活性，对一些疾病有防治作用，如延缓机体衰老、避免冠状动脉硬化、防止白内障发生、延缓早老性痴呆、维持正常的生殖机能、治疗胃溃疡、保护肝脏、调节血压、辅助治疗2型糖尿病等作用[28]。

黑枸杞油中生育酚含量为33.60 mg/100 g，α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的含量分别为11.10、20.50 mg/100 g和1.99 mg/100 g。研究指出，常见的植物油，包括玉米油、橄榄油和花生油，含有高水平的α-TP和γ-TP[29]。生育酚是植物油中主要的脂溶性维生素，在不饱和脂肪酸通过断链反应的过氧化过程中起潜在的抗氧化作用[13]，植物油中的混合生育酚具有预防心血管疾病的有益生物功能，而生育酚的高含量有利于对氧化应激的强保护，赋予油脂相对较好的货架期[14]。橄榄油被认为是迄今所发现的油脂中最适合人体营养的油脂，Yalcin等[30]研究表明，橄榄油中生育酚的含量为26 mg/100 g～100 mg/100 g，与亚麻籽油、米糠油、葡萄籽油和红花籽油的生育酚含量接近[15]，高于茶籽油、牡丹籽油、紫苏籽油、杏仁油、番茄籽油和核桃油[13]。

3 结论

枸杞油是以枸杞资源中所含功效性天然产物为基础所开发的高附加值产品，赋予枸杞及其相关产业以更高的经济效益。本文对由黑枸杞加工副产物制备的黑枸杞油中生育酚和脂肪酸的组成和含量进行分析，与不同加工方式的黑枸杞油、不同种类的枸杞油、不同植物油和新资源籽油的脂肪酸组成和含量进行了比较，结果表明，黑枸杞油UFA含量高达88.70 g/100 g，其亚油酸、亚麻酸和油酸的含量高于大多数的植物油和新资源籽油，并且采用超临界CO2萃取技术得到的油脂脂肪酸的组成更丰富，其生育酚的含量达33.60 mg/100 g。此研究为黑枸杞健康产业的开发及其经济发展、后续进一步研究、普及推广促进全面健康等提供一定的参考。