白藜芦醇苷的抗氧化性及氧化产物分析

陈晨，孙继鹏，赵铮，田瑞红，邓嘉进，姚云平*，李昌模，*

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.桂发祥十八街麻花食品（天津）有限公司，天津 300221）

白藜芦醇苷是从蓼科植物虎杖的干燥根茎中提取到的一种含有二苯乙烯结构的多酚类化合物[1]，又被称为虎杖苷，分子式为C20H22O8，广泛存在于虎杖、葡萄、花生、桑果等天然植物中[2]。研究表明，白藜芦醇苷作为白藜芦醇的一种糖苷衍生物，具有与白藜芦醇类似的生理活性[3]，具有抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、抗心血管疾病[6]等多种对人体健康有益的生物学功能。

目前食品行业有关白藜芦醇苷的研究主要集中在不同原料中的提取工艺、含量及其在贮藏期间的稳定性等方面[7]。研究表明，花生油和葡萄籽油中含有微量的白藜芦醇苷[8]。然而迄今为止关于白藜芦醇苷在油脂中的高温氧化产物的研究鲜见报道[9-10]。

提高油脂的抗氧化性能一直是食用油行业的研究热点，白藜芦醇苷具有多种对人体健康有益的生物学功能，尤其是其具有的强抗氧化能力在食品工业生产领域中能够发挥出巨大的潜能，所以将白藜芦醇苷作为一种天然抗氧化剂加入到食用油脂中，发挥其抗氧化作用，在功能性油脂的开发利用中具有广泛应用前景。因此，本文研究白藜芦醇苷在油脂中的稳定性及其氧化产物的分离鉴定，对指导植物油适度加工并保留有益因子具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白藜芦醇苷（纯度≥95%）：天津所罗门生物科技有限公司；大豆油：嘉里粮油（中国）有限公司；Trolox（纯度≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度≥96%）、三吡啶基三嗪（tri pyridyl triazine，TPTZ）（纯度≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；三氯化铁（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；荧光素钠（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：天津市康科德科技有限公司；盐酸（分析纯）、乙酸（色谱纯）：天津市风船科技有限公司；乙酸钠（纯度＞99%）、无水乙醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-串联质谱（LC-20A）：日本岛津公司；紫外可见分光光度计（TENSOR 27）、Multiskan酶标仪（ELX-808IU）：美国Thermo公司；旋转蒸发仪（RE-2000A）：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 抗氧化能力分析

1.3.1 DPPH自由基清除率的测定

精确称量2.366mg DPPH溶解在甲醇中，制备为浓度60 μmol/L的溶液[11]。将500 μL稀释样品或Trolox标准液（20、40、100、200、300 μmol/L）与 300 μL DPPH溶液混合，在25℃下避光0.5 h，于517 nm处测定吸光度，白藜芦醇苷标准品对DPPH自由基的清除能力用水溶性维生素E（Trolox）的当量（μmol/L TE）表示。根据测得清除率的大小计算白藜芦醇苷的抗氧化性。

式中：A为样品吸光度；A0为甲醇溶液的吸光度。

1.3.2 铁离子还原能力测定

将盐酸溶液（40 mmol/L）和TPTZ试剂混合制备为浓度10 mmol/L的TPTZ储备液[12]。在37℃下将25 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.6）、2.5 mL TPTZ溶液和2.5 mL FeCl3（20 mmol/L）溶液混合以制备铁离子还原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）工作液。取工作液和样品滤液在593 nm下测定其吸光度，计算公式如下。

式中：A为样品吸光度；A0为工作液的吸光度；C为 Fe2+标准浓度，μmol/L。

1.3.3 氧自由基清除能力测定

向96孔黑色酶标板分别加入Trolox（浓度梯度）和白藜芦醇苷标准品溶液25 μL，用多通道移液枪加入 150 μL 荧光素钠（60 μmol/L），于 37℃下中速振摇2 min后保持20 min，设定激发波长为485 nm，发射波长为538nm条件下连续测定荧光强度。测定时需保持体系温度为37℃，每2 min测定1次荧光强度，每次测定前中速振摇10 s，待荧光强度衰减至基线后停止测定[13]。

1.3.4 样品的前处理

精确称量一定量的白藜芦醇苷标准品于10 mL离心管中，向其中加入微量的无水乙醇振荡30 s使其充分溶解，将溶解后的混合溶液分别加入称量好的大豆油中混合涡旋5 min后超声20 min，使白藜芦醇苷完全分散在油中。超声结束后，取5 mL下清液置于旋转蒸发器除去残留乙醇水溶液，获得含10、25、50、100、200 μg/g白藜芦醇苷的油样。将含有不同浓度白藜芦醇苷的50 g大豆油置于9 mm培养皿中，将样品分别在60℃烘箱中加速氧化0～5 d、在180℃烘箱中高温氧化 0～8 h。

1.3.5 过氧化值的测定

参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》对加热过程中的大豆油样品进行过氧化值含量的测定，结果以meq/kg计[14]。

1.3.6 酸值的测定

参考GB 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》对加热过程中的大豆油样品进行酸值的测定，结果以mg/g计[15]。

1.3.7 氧化产物鉴定

1.3.7.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为超纯水、B 为甲醇；流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL。梯度洗脱程序为0～5 min 时 40%A、60%B；5 min～11 min 时变为 40%A；11 min～15 min 时 10%A、90%B；15 min～16 min 时100%B；16 min～25 min 时保持到 65%A[16]。

1.3.7.2 质谱条件

电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）作为离子源，以正负两种模式进行扫描，质谱扫描范围在m/z 90～1000，检测器电压和界面电压分别为1.57kV和4.5kV，加热块温度为200℃[17]。氮气以1.5 L/min的流速用作雾化气体，流动相为甲醇和水，流速为0.2 mL/min。

1.4 数据处理

所有试验均进行3次平行。使用Origin 9.0、Chemdraw软件对数据进行处理并作图，误差线表示平均值的相对误差。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇苷的抗氧化能力

白藜芦醇苷的抗氧化能力见图1。

图1 白藜芦醇苷的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of resveratrol glycosides

由图 1 可知，在 40 μmol/L～200 μmol/L 的浓度范围内，白藜芦醇苷对DPPH自由基清除能力从21.58 μmol TE/L增加到81.83 μmol TE/L、铁离子还原能力从22.77 μmol TE/L 增加到 160.61 μmol TE/L、清除含氧自由基的能力从43.11 μmol TE/L增加到184.47 μmol TE/L，这主要是由于羟基基团的数目是影响白藜芦醇苷抗氧化性的关键因素，白藜芦醇苷结构中的酚羟基能够提供电子和/或氢供体来中和DPPH自由基以及活性氧，阻止自由基的进一步链式反应[18-19]，在链引发阶段，变价金属离子会诱发自动氧化反应，而白藜芦醇苷中还原金属离子的能力可以抑制引发剂中变价金属离子的变价反应，从而起到抗氧化作用。

2.2 过氧化值的测定结果

添加不同浓度白藜芦醇苷的大豆油样品在60、180℃加热过程中的过氧化值如图2所示。

图2 添加白藜芦醇苷的大豆油过氧化值变化Fig.2 Changes of peroxidation value of soybean oil adding resveratrol glycosides

由图2可知，当加热条件为60℃时，加热前3 d，各浓度的样品过氧化值均低于对照组样品，加热进行到4 d时，添加量为100 μg/g和200 μg/g的样品过氧化值急剧增长并且数值大于对照组，浓度为50 μg/g的样品过氧化值最低。当加热温度为180℃时，在氧化初期（加热时间0～4 h）样品的过氧化值与对照组相比差异不大，氧化至8 h时，添加量为200 μg/g浓度的样品过氧化值高于对照组，说明此时高浓度白藜芦醇苷已经开始失去抗氧化作用。在整个加热氧化的8 h内，当白藜芦醇苷添加量为50 μg/g时，过氧化值始终低于对照组并且一直处于最低值，该结果与在60℃条件下得到的结果一致。

2.3 酸值的测定结果

添加不同浓度白藜芦醇苷的大豆油样品在60、180℃加热过程中的酸值见图3。

图3 添加白藜芦醇苷的大豆油酸值变化Fig.3 Changes of soybean oil acid value with addition of resveratrol glycosides

由图3可知，两种加热条件下，随着加热时间的延长，不同样品组的酸值变化和过氧化值的变化趋势一致，在60℃加热0～5 d和在180℃加热0～6 h，浓度为50 μg/g的样品过氧化值和酸值始终低于对照组，说明白藜芦醇苷的添加延缓了大豆油的氧化进程，该结果表明在大豆油中添加50 μg/g的白藜芦醇苷可以有效抑制过氧化物以及不饱和脂肪酸的生成。然而在180℃加热6 h～8 h内，浓度为50 μg/g的样品过氧化值低于对照组，而酸值却高于对照组，这表明该添加白藜芦醇苷的油脂样品在高温条件下长时间加热后体系内不饱和脂肪酸的双键被打开，逐渐形成大量的初级过氧化物，且这些初级过氧化物开始进一步氧化为醛、酮、酸类二次氧化产物，导致此时分解出的游离脂肪酸的含量增加，表明此时油脂开始发生更高程度的氧化。

2.4 白藜芦醇苷的热降解速率

由于在过氧化物生成量和酸值变化中，白藜芦醇苷浓度为50 μg/g的样品较对照组相比表现出最佳的抗过氧化氢生成能力。为进一步了解白藜芦醇苷在氧化过程中的变化情况，因此探究此添加浓度在加速氧化过程中白藜芦醇苷的热降解率，结果如图4所示。

图4 白藜芦醇苷降解率示意图Fig.4 Degradation rate diagram of resveratrol glycosides

由图4可知，随着加热时间的延长，白藜芦醇苷的浓度逐渐降低。在60℃加热条件下加热0～5 d，白藜芦醇苷的浓度由50.00 μg/g降解为7.72 μg/g。加热0～2 d内，白藜芦醇苷的浓度急剧下降为10.40 μg/g，降解率为79.2%。加热至5d时，白藜芦醇苷的降解率达到85%。在2 d～5 d内白藜芦醇苷的损失量变化较小，同时在该加热阶段内的大豆油过氧化值和酸值增长也较为平缓，表明在此时间段内大豆油氧化程度趋于稳定。在180℃加热条件下，降解1 h后白藜芦醇苷的降解率为73.68%，加热1 h～8 h阶段，白藜芦醇苷的降解率由73.68%逐步增加到83.78%，含量变化逐渐减小。

2.5 白藜芦醇苷的氧化产物鉴定

为了进一步了解白藜芦醇苷在高温加热条件下生成的氧化产物，采用高效液相色谱串联质谱对添加50 μg/g白藜芦醇苷的大豆油样品在60、180℃加热过程中生成的热氧化产物进行检测和鉴定，结果如图5所示。

由图5可知，在二极管阵列检测过程中，添加白藜芦醇苷的样品经60℃加热后除了出现目标物，还出现了5个额外峰，经180℃加热的样品与对照组相比生成6个峰，表明白藜芦醇苷在氧化时生成了新的氧化产物。

图5 白藜芦醇苷在两种加热条件下的色谱Fig.5 Chromatographic of resveratrol glycosides under two heating conditions

以ESI为离子源，在负离子扫描模式下，白藜芦醇苷的全扫描一级质谱以准分子离子峰m/z 389[M-H]－为基峰[20]。白藜芦醇苷氧化产物的裂解途径见图6。

图6 白藜芦醇苷氧化产物裂解途径示意图Fig.6 Diagram of the cleavage pathway of resveratrol glycosides oxidation products

由图5、图6可知，1号峰（m/z 138.03）的产物结构来自白藜芦醇苷二苯乙烯结构中连接两个苯环的双键发生氧化断裂，导致3，5-二羟基苯甲醛作为氧化产物生成。2号峰（m/z 227.08）的产物为白藜芦醇苷糖苷键断裂所生成的白藜芦醇。3号峰（m/z 436.13）是由两分子的2号产物在负离子模式下结合生成[2M-H]-的二聚体分解生成的碎片离子[21]。5号峰（m/z 306.09）的产物离子是由m/z 435二聚体结构中的四氢呋喃环发生CO醚键断裂以及C-C键断裂生成的产物离子。4号峰（m/z 244.07）的氧化产物对应于白藜芦醇的[M+O-1]-的分子离子峰。加热过程中二苯乙烯结构上2'、3'位和4'、5'位之间两个化学键发生键断裂导致失去1分子C2H2O（42 Da）后，在断键位置处形成缺电子活性中心，从而促使间苯二酚的苯环开环形成m/z 185.10（7号峰）的产物离子。在此基础上，4'-OH所连接的碳原子上的一个烃基带着电子对发生迁移，羟基氧原子上未共用电子转移到碳氧之间形成双键，经环化作用后形成6号峰（m/z 171.04）的产物离子。

3 结论

本文研究不同浓度的白藜芦醇苷添加在大豆油后，其添加浓度与油脂理化指标的量效关系，结果表明：添加50 μg/g白藜芦醇苷对大豆油的热稳定性起到最好的抗氧化效果。基于此结果模拟60℃烘箱加速氧化以及180℃高温油炸两种条件对白藜芦醇苷氧化稳定性的影响，并采用高效液相色谱串联质谱法监测在氧化过程中白藜芦醇苷及其氧化热降解产物的变化，监测到质荷比分别为 138.03、171.04、185.10、227.08、436.13、244.07、306.09的7种氧化产物并推测其裂解机制，为进一步了解白藜芦醇苷的裂解机理和氧化产物生成途径提供了依据，该结果为白藜芦醇苷在食用油抗氧化领域的开发应用提供了参考。