BRCA1/2基因突变对乳腺癌保乳术后局部复发的影响及相关预后模型的构建

张明坤，王哲，杨柳，侯兰，张聚良

（中国人民解放军空军军医大学第一附属医院 甲乳血管外科，陕西 西安 710032）

国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症统计数据显示，2020 年全球约有1 930 万新增癌症病例和1 000 万癌症死亡病例，其中发病数最多的是女性乳腺癌（226 万例）[1]。保乳手术能够保留患者的乳房外形，极大地改善患者术后的心理状态和生活质量现已成为乳腺癌的标准手术方式之一。van Maaren 等[2]研究表明，接受保乳手术及术后放疗的乳腺癌患者的10 年总生存及10 年无远处转移生存均优于接受乳房全切治疗的患者。1988—1998 年，美国的保乳率从18.7% 升至64.5%[3]。但在我国，仅有5.5% 的医院保乳率在40% 以上，有50% 的医院保乳率不到20%，有16.3%的医院保乳率不到10%，而且保乳率高低与医院所在地区人均GDP 和医院年手术量呈正相关[4]。目前，我国保乳率低的主要原因是医师对保乳治疗经验不足，担心保乳术后局部复发率增加，将保乳治疗的适应证控制得过于严格，由于我国在保乳治疗方面起步相对较晚，所以即便是在我国的一些城市地区保乳经验缺乏仍属于普遍现象，农村地区更是如此[5]。因此，分析保乳术后乳腺癌患者局部复发的高危因素，并建立相关临床预测模型，对于提高保乳率，改善患者术后生活治疗有重要意义。

遗传性乳腺癌占所有乳腺癌病例的5%～10%[6]。在遗传性乳腺癌中，BRCA1/2 突变是最常见的致病突变，并以常染色体显性方式遗传[7]。BRCA1/2 是与乳腺癌密切相关的易感基因，到70 岁时，BRCA1 突变使乳腺癌风险增加65%，BRCA2 突变使乳腺癌风险增加45%[8]。目前，大多数学者认为，BRCA1/2 突变并不影响乳腺癌患者的总生存，但BRCA1/2 突变对于保乳术后同侧乳腺肿瘤复发的影响尚有争议[9]，NCCN 指南[10]中也仅将BRCA1/2突变列为保乳手术的相对禁忌证。本研究回顾性分析了189 例接受保乳手术乳腺癌患者的BRCA1/2突变及相关临床病理因素与局部复发的相关性，并构建列线图模型来预测患者的无局部复发生存（local recurrence free survival，LRFS）率，为患者的手术方式选择及个体化诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 资料收集

收集2014 年6 月—2016 年6 月中国人民解放军空军军医大学第一附属医院收治的189 例乳腺癌患者，纳入标准：⑴ 病理确诊为乳腺癌的女性患者；⑵ 接受保乳手术，并接受标准方案的术后放疗；⑶ 接受系统性的全身治疗，包括化疗，内分泌治疗，靶向治疗等；⑷ 有完整的临床病理及随访资料。本研究获得了所有参与者的知情同意，并经伦理委员会审查批准，伦理审批号：KY20212051-C-1。

1.2 方法

1.2.1 BRCA1/2 检测 ⑴ 样本采集与提取：EDTA抗凝管采集患者外周静脉血2 mL，（-20±5）℃条件下低温保存。应用厦门艾德新鲜血液核酸提取试剂盒对全血样本进行DNA 提取，洗脱体积为100 μL，样本浓度>5 ng/μL，总量>450 ng。⑵ 文库构建：应用厦门艾德人类BRCA1 基因和BRCA2基因突变检测试剂盒体外定性检测患者外周血样本DNA 中BRCA1/2 的突变情况。检测范围包括BRCA1 基因和BRCA2 基因的全编码区（BRCA1 基因外显子2、3、5～24，BRCA2 基因外显子2～27）及外显子-内含子连接区、UTR 区（非翻译区）和启动子区的点突变和插入缺失突变。⑶ 测序及分析：使用Illumina MiSeq Dx 测序仪进行测序，测序数据应用人类12 基因高通量测序数据分析软件（ADXBRCA 模块）进行分析。

1.2.2 随访 随访方式为门诊随访和电话随访，随访时间为47～71 个月，中位随访时间61 个月。随访截止至2021 年6 月。随访内容：肿瘤有无局部复发，及复发的时间，生存状况。死亡患者需记录死亡时间及死因。

1.3 统计学处理

采用R 软件（4.0.3）进行统计学分析并绘制列线图。采用χ2检验和Fisher 精确检验比较不同临床病理特征下BRCA1/2 突变的差异，对于等级资料进行Mann-WhitneyU秩和检验，连续资料进行t检验，采用Kaplan-Meier 法计算LRFS 率，Log-rank 法检验评价各变量的不同亚组生存差异。通过单因素及多因素Cox 等比例风险回归模型分析影响保乳术后乳腺癌患者局部复发的独立危险因素，通过C-index、校准曲线和临床决策曲线分析（decision curve analysis，DCA）验证模型的可靠性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BRCA1/2 基因突变乳腺癌患者的临床病理特征

189 例患者中有16 例BRCA1/2 致病突变阳性，其中BRCA1 突变14 例，BRCA2 突变2 例。未突变组的平均年龄为54 岁，突变组的平均年龄为44 岁，两者比较差异有统计学意义（P=0.026）。突变组和未突变组的分子分型进行比较差异有统计学意义（P<0.001）（表1）。

表1 BRCA1/2突变和未突变患者的临床病理特征[n（%）]Table 1 Clinicopathologic features of BRCA1/2 mutant and non-mutant patients [n (%)]

2.2 BRCA1/2 突变及其他因素对保乳术后乳腺癌患者局部复发的影响

在189 例患者中，对BRCA1/2 突变及其他因素进行Cox 单因素分析，结果显示：BRCA1/2 突变、肿瘤分级、肿瘤大小、N 分期及分子分型等5 个变量是保乳术后乳腺癌患者LRFS 率的影响因素（P<0.1）。将单因素Cox 回归筛选的5 个变量纳入多因素Cox 回归模型，经向后法逐步回归AIC 分析后结果显示：BRCA1/2 突变、肿瘤大小、N 分期及分子分型等4 个变量是保乳术后乳腺癌患者LRFS 率的独立危险因素（P<0.05）（表2）。基于Kaplan-Meier和Log-rank 检验方法，利用Cox 风险模型绘制出各主要变量的生存曲线（图1）。

图1 筛选因素对患者LRFS率影响的生存曲线分析Figure 1 Survival curve analysis of influences of the main variables on the LRFS of patients

表2 影响保乳术后乳腺癌患者LRFS 率的单因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors for LRFS in breast cancer patients undergoing breast conserving surgery

2.3 保乳术后乳腺癌患者LRFS 率列线图模型的构建

基于Cox 等比例风险回归模型分析的结果（图2），构建保乳术后乳腺癌患者LRFS 率的列线图预测模型（图3）。将列线图中各个变量所得分值相加的总分可预测保乳术后乳腺癌患者3 年和5 年的LRFS 率。

图2 LRFS率高危因素的森林图Figure 2 Forest map of high-risk factors of LRFS

图3 LRFS率列线图预测模型Figure 3 Nomogram prediction model of LRFS

2.4 列线图预测模型的验证

构建模型的C-index 为0.86，经bootstrap 法自助抽样1 000 次内部验证C-index 为0.81，显示模型具有较好的区分度。对保乳术后乳腺癌患者3 年及5 年的LRFS 率预测进行ROC 曲线分析，曲线下面积（area under curve，AUC）分别为：0.89 和0.85，显示模型具有较好的准确度（图4）。为评估模型是否存在过度拟合，在模型中，分别根据患者的3 年和5 年LRFS 率绘制校准曲线，结果显示所有的校正曲线均与理想曲线有较好的吻合度，提示模型预测有较好的校准度和准确性（图5）。

图4 模型的3、5年LRFS率的ROC曲线分析Figure 4 ROC curve analysis of the model on 3-and 5-year LRFS

图5 模型的3、5年LRFS率的校准曲线Figure 5 Calibration curves of the model on 3-year and 5-year LRFS

2.5 列线图预测模型的临床决策曲线分析

针对列线图模型的3 年及5 年的LRFS 率分别绘制DCA 曲线，其中黑色横线代表所有样本均为阴性、获益为0，灰色斜线表示所有样本均为阳性，虚线为模型的净获益情况，无论是3 年还是5 年的预测LRFS 率，模型的临床净获益均较高，显示模型的临床效能较好（图6）。

图6 保乳术后乳腺癌患者的3年和5年LRFS率的DCA曲线Figure 6 DCA curve of 3-and 5-year LRFS in breast cancer patients undergoing breast conserving surgery

3 讨 论

大多数文献[11-14]报道中，BRCA1/2 基因在乳腺癌患者中的突变率约为0.85%～3.0%,而本研究中，BRCA1/2 突变率为8.47%，这可能与我国乳腺癌患者平均年龄较低有关 。研究[15]表明，乳腺癌患者的年龄越小，BRCA1/2 基因的突变率越高，于洗河等[16]研究显示，中国女性乳腺癌的发病高峰年龄为55～59 岁，而本研究中，所有患者的平均年龄为52 岁，均远低于国外文献报道的65～74 岁[17]。同时，在本研究中，BRCA1/2 突变患者的平均年龄为44 岁，明显小于BRCA1/2 未突变的患者的54 岁，这与Zhang 等[18]研究相符合。本研究发现，乳腺癌患者不同的分子分型中BRCA1/2 基因的突变率有明显差异，其中，三阴性乳腺癌中BRCA1/2 突变率高达26%，明显高于其他各分型，这与北京大学肿瘤医院乳腺中心实验室的研究[19]结果相符，该研究中发现国内年轻乳腺癌患者和三阴性乳腺癌患者BRCA1/2 基因的突变率分别可达23% 和20%。BRCA1/2 基因突变与乳腺癌的发生发展密切相关，BRCA1/2 蛋白在细胞分裂过程中对染色体结构和基因序列的完整性起到监护作用，从而预防肿瘤的发生[20-21]。BRCA1/2 是哺乳动物细胞启动HR 修复不可或缺的因子，当BRCA1/2 缺失时，DNA 损伤会引发非忠实性修复，如非同源末端链接修复（nonhomologous end joining，NHEJ）或微同源末端链接修复（microhomology-mediated endjoining，MHEJ）[22-23]。

保乳手术已成为乳腺癌的重要手术方式之一，如何在提高保乳率，改善患者的生活质量的同时减少患者术后的局部复发率是乳腺癌治疗的重大挑战，如果能在术前预测出乳腺癌患者接受保乳手术后的局部复发率，将对手术方式的选择提供重要的科学依据。列线图是多因素预后模型的图形表现形式，可用来个体化预测特点时间点患者的生存情况[24]。列线图作为一种新型预测模型，与传统预测方法相比，准确性更高，适应性更广，并且易于推广[25]。已被广泛应用于口咽癌[26]、胃癌[27]、乳腺癌[28]和肺癌[29]等多种癌症的预后预测。本研究中，构建了列线图模型来预测接受保乳手术的乳腺癌患者术后的局部复发率，并通过C-index、ROC 曲线、校准曲线以及DCA 曲线分析来评估模型的区分度和准确性。结果显示，构建的列线图模型具有较为准确的预测能力，能够有效地指导临床决策。

Vallard 等[30]研究显示，BRCA1/2 突变的患者，无论是接受保乳手术还是乳房全切手术，局部复发率和总生存率都没有明显差异。但Davey 等[31]研究表明，BRCA1/2 突变的乳腺癌患者接受保乳手术与乳房全切手术相比，局部复发风险增了4.54 倍（95%CI=2.77～7.42，P<0.001）。本研究结果与Davey等[31]的研究结果相符，本研究显示BRCA1/2 突变是保乳术后乳腺癌患者局部复发的独立危险因素。同时，本研究结果显示，肿瘤大小、N 分期及分子分型也是保乳术后乳腺癌患者局部复发的独立危险因素。肿瘤越大，N 分期越高，患者的局部复发风险越高；三阴性乳腺癌的局部复发风险也明显高于其他类型的乳腺癌，这与既往的研究结果相符[32]。

综上所述，本研究通过分析189 例接受保乳手术的乳腺癌患者的临床病理资料及BRCA1/2 突变情况，确立了BRCA1/2 突变、肿瘤大小、N 分期和分子分型是保乳术后乳腺癌患者局部复发的独立危险因素，将这些因素纳入并构建列线图预测模型，能够准确地预测患者的3、5 年LRFS 率，为临床的个体化诊疗提供科学依据。但本研究仍存在一些局限性，由于本研究的样本量较少，导致BRCA1/2突变阳性的样本也较少，这些都会影响临床预测模型的区分度和准确性，同时，由于本研究中分析的都是2014—2016 年的患者，时间较为久远，一些重要的影响预后的因素未能纳入，例如是否进行新辅助化疗、新辅助治疗的方案及肿瘤退缩模式等，可能会增加偏倚的风险。因此，未来可能需要更大样本量的研究，进行更全面的分析，对模型进行进一步的优化和验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。