WAVE2与替代型结直肠癌肝转移生长模式的相关性研究

裴雷，谭风波，裴谦，罗嘉，王志明，陶一明

（1.中南大学湘雅二医院 普通外科，湖南 长沙 410011；2.中南大学湘雅医院 普通外科，湖南 长沙 410008；3.湖南省肿瘤医院 肝胆外科，湖南 长沙 410031）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球一种导致癌症相关死亡的疾病[1]。肝脏是CRC 转移的常见部位[2]，大约50% 的CRC 患者出现肝转移（colorectal cancer liver metastases，CLM），手术后5 年总生存率约为40%[3]。在CLM 组织病理学检查中，可以观察到CLM 和临近肝组织之间的界面处会出现不同的组织病理学生长模式（histopathological growth patterns，HGP）。肝转移HGP 评估国际共识指南（2017 版）[4]界定了3 种主要亚型：促纤维组织增生型HGP（desmoplastic histopathological growth pattern，DHGP）、替代型HGP（replacement histopathological growth pattern，RHGP）和膨胀型HGP（pushing desmoplastic histopathological growth pattern，PHGP）。新近研究[5]表明，HGP 亚型之间存在相当大的生物学差异。与DHGP 的CLM患者相比，CLM 中存在RHGP 的患者预后较差，可能和肝切除阳性切缘有一定内在关系，容易复发转移[6]。DHGP 的血管生成特征是肿瘤边缘肿瘤血管新生，而RHGP 则主要通过血管选定（vessel cooption）。

值得关注的是，血管选定是肿瘤一种新的血管生成方式，在肝转移肿瘤生长及抵抗治疗中发挥重要功能[7]。然而，在RHGP 中驱动血管选定的分子病理机制尚不十分清楚[8]。因此，探索血管选定的病理及潜在分子机制，不仅可以拓宽对CLM的认识，也为更好地控制CLM 提供了新的治疗靶点。研究[9]报道，细胞运动关键调控基因WAVE2表达与CLM 的关系密切相关。此外，WAVE2 在CLM 组织中的高表达，与CLM 微血管密度有关。笔者团队[10]发现HSC 中WAVE2 的表达与TGF-β1 和YAP1 信号通路的激活相关。本研究旨在通过CLM组织标本，采用免疫组化和生物信息分析的方法，研究WAVE2 表达与CLM 与RHGP 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

CLM 石蜡组织样本共104 例，其中仅1 例病理评估为PHGP，因例数过少未纳入本研究。研究共纳入2010—2020 年于中南大学湘雅医院普通外科行手术切除的CLM 患者103 例。男63 例，女40 例；右半结肠癌24 例，左半结肠癌45 例，直肠癌34 例；术前接受化疗者15 例，接受放疗者2 例。本课题研究内容已报中南大学湘雅医院医学伦理委员会审批备案（批件编号：201103768），同意实施。

1.2 HGP病理评估

HGP 病理评估根据2017 年国际共识指南标准[4]进行：当CLM 肿瘤周围有纤维化边缘并且癌细胞和肝细胞之间没有接触时，确定为DHGP。在无瘤周纤维化边缘并且当癌细胞长入肝实质并与肝细胞密切接触时，确定为RHGP。HGP 评估由2 名独立的病理医生完成。

1.3 免疫组化染色和评估

CLM 石蜡切片置入60 ℃烤箱，烤片24 h。用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，然后EDTA 抗原修复液微波炉进行抗原修复10 min，PBS 缓冲液洗涤。其中WAVE2 抗体（货号ab204376）的工作浓度为1∶500。CD31 抗体（货号DAKO22C3）工作浓度为1∶500。WAVE2 染色强度按文献[10]报道计算H 评分计算，以H 评分87.5（cut-off 值）界定WAVE2 的高低表达。肿瘤微血管染色，通过其平均数量来分析任何棕色染色的内皮细胞或与相邻微血管明显分离的内皮细胞簇。

1.4 Masson染色

CLM 切片脱蜡步骤同上，0.5% 碘酒精作用10 min。水洗后5%硫代硫酸钠作用5 min，流水冲洗10 min。Weiger 铁苏木素染色5 min，流水洗涤。1%盐酸酒精分化。丽春红酸性品红液染色5 min，蒸馏水稍冲洗。1%磷钼酸水溶液处理5 min，用苯胺绿液复染5 min。1%冰醋酸处理1 min。95%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固镜检。

1.5 生物信息学分析

使用TIMER2.0 数据库（http://timer.cistrome.org）进行肿瘤免疫浸润的相关性分析[11]。WAVE2 的表达与COAD 患者中6 种浸润性免疫细胞（B 细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞，树突状细胞）之间的关联进行了评估。

1.6 统计学处理

各组间半定量计数资料比较采用Fisher 精确概率法分析，用GraphPad Prism Version 9.02 软件分析制图。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CLM的HGP病理特征分析

CLM 组织切片HE 染色后进行HGP 评估（图1A），可以观察到在DHGP 中，纤维增生边缘（左上）和肿瘤细胞（右下）之间的直接接触；RHGP 肿瘤细胞（左下）和肝实质（右上）之间的直接接触。Masson 染色显示，DHGP 比RHGP 具有更多致密的细胞外基质（图1B）。

图1 两种HGP病理特征比较 A：组织切片HE染色；B：组织切片Masson染色Figure 1 Comparison of the pathological features between the two types of HGP A: HE staining;B: Masson staining

2.2 CLM的HGP临床病理特征分析

本组56.3%（58/103）病理检查确定为DHGP，46.6%（45/103）病理检查确定为RHGP。103 例CLM 患者临床病理特征见表1。通过比较分析两种HGP 亚型与临床病理特征的关系，结果显示，RHGP 与肝转移瘤发生时间（P=0.023）及淋巴结转移（P=0.009）明显有关。

表1 HGP与CLM患者的临床特征的关系[n（%）]Table 1 Relations of HGP with the clinical features of CLM patients [n (%)]

2.3 CLM组织HGP与血管选定特征

CLM 配对组织进行CD31 标记微血管密度（图2A），结果发现，在本组58 例DHGP 患者中，16 例（27.5%）患者观察到血管选定；45 例RHGP患者中，17 例（37%）患者观察到血管选定；两组比较差异有统计学意义（P=0.023）（图2B）。

图2 两组血管选定的比较结果 A：CD31染色结果；B：按HGP分层的血管选定表达的患者比例Figure 2 Comparative results of vessel co-option between the two groups A: CD31 staining;B: Pie chart graph by proportion of vessel co-option stratified by HGP

2.4 WAVE2表达与HGP的相关性

既往研究[12]发现WAVE2 是调控细胞迁移运动的潜在关键分子。103 例CLM 患者组织进行了WAVE2 免疫组化染色分析（图3A）。结果发现，在本组58 例DHGP 患者中，34 例（58.6%）患者观察到高表达，24 例（41.4%）患者观察到低表达；45 例RHGP 患者中，37 例（82.2%）患者观察到高表达，8 例（17.8%）患者观察到低表达；两者比较差异有统计学意义（P=0.011）（图3B）。

图3 WAVE2表达的免疫组化检测结果比较 A：WAVE2染色结果；B：按HGP分层的WAVE2表达比例Figure 3 Comparative results of WAVE2 expression between the two groups A: WAVE2 staining;B: Pie chart graph by proportion of WAVE2 stratified by HGP

2.5 WAVE2表达与免疫浸润的相关性

新的研究[13]证据表明，WAVE2 在调节免疫细胞功能中至关重要。笔者通过TIMER 2.0 数据库评估COAD 中WAVE2 表达和肿瘤免疫浸润之间的关联。结果表明，WAVE2 表达与肿瘤纯度无关，但是WAVE2 表达与B 细胞（r=0.258，P=1.41e-07）、CD4+T 细胞（r=0.467，P=3.67e-23）、CD8+T 细胞（r=0.318，P=5.47e-11）、中性粒细胞（r=0.407，P=2.02e-17）、巨噬细胞（r=0.301，P=6.63e-10）和树突状细胞（r=0.438，P=3.01e-20）的肿瘤免疫浸润水平呈明显正相关（图4），提示WAVE2 可能是肿瘤免疫微环境的新调节因子。

图4 结肠癌中WAVE2表达与免疫浸润的相关性Figure 4 Correlation between WAVE2 expression and immune infiltration in colorectal cancer

2.6 WAVE2激活的信号传导分子分析

为初步探讨WAVE2 信号传导及通路可能参与替代型HGP 与血管选定形成的分子机制，根据KEGG 数据库中的Pathway 间的相互作用关系方法分析，结果表明WAVE2 信号激活下游分子，如Arp2/3 复合物、TIMM50、CTTN、HDAC4、CYFIP1、CDC42、PDGFB、PRKACA 等（图5）。表明WAVE2信号激活在癌症进展中极为重要。

图5 WAVE2相互作用信号分子网络分析Figure 5 Molecular network analysis of WAVE2 interaction signaling

2.7 WAVE2信号传导通路分子的相关性分析

利用TIMER2.0 研究COAD 中WAVE2 信号通路相关基因表达相关性。结果显示，WAVE2 基因表达水平与CTTN（r=0.454，P=1.26e-24）、HDAC4（r=0.54，P=5.43e-36）、CYFIP1（r=0.39，P=4.24e-18）、CDC42（r=0.443，P=2.12e-23）、PDGFB（r=0.316，P=4.25e-12）、PRKACA（r=0.363，P=1.05e-15）等下游分子均呈明显正相关（图6）。进一步提示WAVE2 信号通路激活在CLM 过程中起重要作用，可能参与RHGP 与血管选定形成。

图6 结肠癌中WAVE2信号传导分子相关性分析Figure 6 Correlation analysis of WAVE2 and signaling pathway molecules in colorectal cancer

3 讨 论

通过对特定生物标志物检测，筛选分类患者，对CLM 的病理特征和分子机制深入研究，有助于为患者制定最佳的治疗策略。2017 年颁布的肝转移HGP 模式评分国际共识指南[4]提供了简单易行的预测指标判断肝转移瘤的肿瘤生物学行为并指导治疗。HGP 在可切除的CLM 的苏木精和伊红染色切片上进行评估，是一种可靠的、可重复的和强有力的预后生物标志物。评估CLM 的HGP 对预测预后有重要意义[14]。本研究中，在103 例行手术切除的CLM 患者中观察到58 例DHGP 和45 例RHGP，证实了DHGP 和RHGP 为中国患者肝转移瘤的主要生长模式。同时，笔者通过分析生长模式与临床病理特征的相关性，发现与肝转移瘤发生时间和淋巴结转移相关。考虑到术前化疗诱导改变CLM的HGP 的组织病理学变化，化疗与促纤维增生性HGP 的增加独立相关[15]，由于本研究纳入的术前化疗患者仅15 例，本研究未能观察到化疗与HGP的相关性。这一结果提示，DHGP 和RHGP 可能具有不同的肿瘤生物学行为及作用机制。

众所周知，血管生成在CLM 发生发展中至关重要。尽管诱导新生血管生成的能力长期以来一直被认为是这一目的所必需的。但迄今为止，抗血管生成疗法在患者中仅显示出部分有效的疗效。血管选定这一以往被忽视的新的血管化机制，因其在抗血管生成疗法抗性中的作用以及在肿瘤休眠和侵袭期间癌细胞的血管周围定位和迁移模式的报道，受到了新的关注[16]。新近研究[17]表明，肿瘤细胞可以通过增强迁移运动能力，劫持周围非恶性组织的已经存在的血管形成血管选定，而非新生成血管，促进转移和影响治疗反应。本研究在103 例CLM 交界组织中观察到微血管密度与HGP显著相关，提示RHGP 和DHGP 存在血管选定差异。DHGP 通过血管生成机制，对抗血管生成药物有反应，与之不同的是，RHGP 则通过血管选定机制，并且对抗血管生成药物治疗不敏感。这表明血管选定可能是对抗血管生成疗法重要耐药机制之一。

DHGP 与增加的血管生成能力和细胞毒性T 细胞的浸润增加有关，而RHGP 主要通过联合预先存在的肝窦血管来建立血管化[18]。此外，在这些肿瘤中观察到免疫细胞浸润减少和癌症运动性增加。当癌细胞窃取血管时可增加它们移动的能力，从而表明，靶向癌细胞的运动，可以用来阻止血管选定。因此，探索这些血管选定的潜在机制，不仅可以拓宽对肿瘤的认识血管生成，也为更好地控制癌症生长和转移提供了新的治疗靶点。为了探讨其可能机制，笔者关注到WAVE2 这一调控细胞迁移运动的潜在关键分子。WAVE2 已被充分证明与包括结肠癌在内的多种人类癌症的发病机制有关[19]。本研究观察到WAVE2 表达在DHGP 和RHGP 中的存在显著性差异。生物信息学分析提示WAVE2 表达和结肠癌中肿瘤浸润免疫细胞关联。WAVE2 激活CTTN、HDAC4、CYFIP1、CDC42、PDGFB、PRKACA 等下游分子，WAVE2 基因表达水平与其均呈显著性正相关。WAVE2 已被证明在小GTPase 和肌动蛋白细胞骨架之间形成关键联系。通过激活Arp2/3 复合物，已被证明在CRC 细胞侵袭和转移中起关键作用[9]。此外，TGF-β1 介导WAVE2 上调HSC 活化，并在体外和体内促进a-HSCs转移，表明存在涉及WAVE2 和YAP1 驱动CLM 的关键信号通路[10]。WAVE2 还可以通过抑制mTOR的激活，维持T 细胞的平衡，参与调节免疫微环境[13]。本研究进一步证实WAVE2 调控细胞迁移运动和参与肿瘤免疫微环境，并且WAVE2 的高表达促进RHGP 形成。

综上所述，WAVE2 在CLM 中赋予血管选定和HGP 模式的机制途径，需要进一步的研究来确定参与这种机制的其他分子。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。