卵巢癌移植瘤裸鼠不同时期靶向超声造影参数与癌细胞生长关系研究

王 音，杨文娟

(1.西安大兴医院超声医学科,陕西 西安 710016；2.西安秦皇医院超声医学科，陕西 西安 712000)

临床上多通过肿瘤标志物、妇科检查、超声检查联合筛查卵巢肿瘤，其中超声造影技术会因内部血管、肿瘤周围血管较敏感，同时可用于病理包块性质的诊断，超声造影可在外周静脉将造影微泡摄入，让造影微泡在血液和血管中出现化学、物理效应，出现散射现象，从而增强血管显影程度[1-2]。超声造影剂对肿块良恶性鉴别要点是判断良恶性病变的血供能力，恶性病变多有较丰富的血供来支持肿瘤的浸润生长，而恶性肿瘤并不是均具有该鉴别点，使得造影剂特异度低于敏感度[3]。目前国内应用较广泛的是声诺维第三代含氟碳类气体微泡造影剂，其可精准显示组织血流情况，用定量软件评估造影参数。近年来，随着超声造影技术的不断创新，靶向超声造影提高了恶性肿瘤的诊断特异性，已应用于临床中，也给卵巢癌早期诊断提供了新的诊断依据及方向[4]。CXC趋化因子配体12(CXC chemokine ligand 12，CXCL12)是卵巢癌微环境中的一个重要靶点[5]，因此本研究制备携带CXCL12抗体的一种靶向超声微泡，通过抗原-抗体反应，结合卵巢癌肿瘤新生血管上皮中CXCL12高表达的特点实现卵巢癌微环境CXCL12的靶向识别，对不同时期卵巢癌移植瘤裸鼠超声造影参数与癌细胞生长的关系进行分析，以为卵巢癌早期诊断、靶向治疗提供新的分子影像学方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性裸鼠50只，18～22 g，品系为BALB/c-Nude，周龄6～8周，给予SPF级饲养。

1.2 实验试剂与仪器 人卵巢癌SKOV3细胞(批号：CL-0215)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；兔抗CXCL12(批号：109637)购自上海纽普生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；Sono Vue造影剂购自意大利Bracco公司；生物素化脂质购自Life Technologies公司；链霉亲和素购自Sigma公司；血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)酶联免疫吸附试剂盒(批号：ab270206、ab214571、ab207615、ab197751)购自英国Abcam公司；酪氨酸激酶受体2(Tie-2)和E74样因子5(ELF5)酶联免疫吸附试剂盒(批号：ml002942、ml163294)购自上海酶联生物科技有限公司。离心管(15、50 ml)、细胞培养瓶(25 ml)、0.25%胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；微量加样枪购自德国Ependorf公司，Mylab90彩色超声仪购自意大利百胜公司；离心机、CO2培养箱、荧光倒置显微镜、普通显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 人卵巢癌SKOV3细胞培养：采用全培养基(10%胎牛血清、含DMEM高糖培养基、100 μg/ml链霉素、100 μg/ml青霉素)进行细胞培养。细胞传代后，将其置入含5% CO2、37 ℃细胞培养箱中，隔天更换培养液，之后在显微镜下对细胞生长情况进行观察。细胞完全融合成片或80%融合时进行传代，每3～4 d传代1次。

1.3.2 裸鼠皮下卵巢癌移植瘤模型制备：选取SKOV-3卵巢癌细胞传代3代后的对数生长期细胞，将旧培养基吸出后用PBS吹洗细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞，之后将细胞悬液吸入至离心管中离心5 min，离心速度为1000 r/min。待上清液吸出后，注入完全培养液，之后细胞计数，调整浓度为1×107个/ml。乙醇消毒50只裸鼠右臀背部，之后皮下接种0.2 ml卵巢癌细胞悬液，约含有细胞1×107个/ml，隔天对瘤体生长情况进行观察。之后分别在造模后第10、20、30、40、50天时分别选取10只裸鼠行超声造影检查。

1.3.3 超声造影剂制备：向含有声诺维干粉末的瓶中混入磷酸缓冲液5 ml，制成微泡混悬液，观察微泡状态，在4 ℃冰箱中保存待用。向声诺维中加入3 ml磷酸缓冲液和生物素化脂质450 μg，0 ℃下孵育30 min。静置分层后丢弃下清液，加入100 μg链霉亲和素，0 ℃下孵育30 min。静置分层后取上层乳白色微泡，将未结合链霉亲和素弃去，在4 ℃条件下保存。之后在上述生物素-亲和素脂质微泡中加入1.5 μg兔抗CXCL12抗体，冰上孵育30 min。静置分层后弃去未结合抗体，在4 ℃条件下密封保存。

1.3.4 超声造影剂鉴定及检测：①分别抽取制备好的两种超声微泡悬浮液2 ml，添加罗丹明标记的山羊抗大鼠IgG，冰上0 ℃孵育30 min，静置分层后丢弃下清液及未结合的二抗，分别取10 μl普通、靶向微泡造影剂，观察其微泡荧光情况。②取1 ml靶向超声造影剂，充分混合后各抽取10 μl，再加入1 ml磷酸缓冲液，用计数仪检测两种微泡的平均浓度、直径。在普通显微镜下观察微泡形态，同时在荧光显微镜下观察微泡结合情况，记录荧光强度，使用流式细胞仪检测超声微泡携带CXCL12单克隆抗体的稳定性及携带率。

1.4 观察指标 ①分析超声微泡物理性状及荧光鉴定结果；②统计人卵巢癌移植造模结果；③对比造模第10、20、30、40、50天时普通与靶向超声造影参数(峰值强度、达峰时间及平均渡越时间)；④在不同时间点超声造影完成后处死裸鼠，剥离肿瘤，使用酶联免疫吸附试剂盒检测血管新生分子蛋白血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、酪氨酸激酶受体2(Tie-2)、细胞增殖蛋白[细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、E74样因子5(ELF5)]、细胞侵袭蛋白[胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)、E-上皮钙黏附素(E-cadherin)]水平；⑤分析靶向超声造影参数与癌细胞生长的相关性。

2 结 果

2.1 超声微泡物理性状及荧光鉴定结果 微泡肉眼观察呈乳白色，普通显微镜下微泡细密、透亮、分布均匀，静置过夜后出现分层。靶向与普通微泡对比，形态、大小均无差异。加入罗丹明标记后的山羊抗IgG抗体孵育后，经荧光显微镜观察发现靶向造影微泡出现明亮红色荧光，普通造影微泡无荧光。

2.2 人卵巢癌移植造模结果 本研究50只裸鼠均造模成功，造模10 d后裸鼠背部出现米粒样凸起，20～30 d时肿瘤瘤体达到1 cm，40～50 d时瘤体均超过1 cm，部分瘤体出现坏死，40 d时部分瘤体表面出现红色结痂，50 d时瘤体表面出现黑色结痂。

2.3 普通与靶向超声造影造模后不同时间点峰值强度、达峰时间、平均渡越时间比较 见表1～3。造模后不同时间点，普通超声造影的峰值强度、达峰时间、平均渡越时间比较差异无统计学意义(F=0.188、0.045、0.017，均P>0.05)；而靶向超声造影的峰值强度、达峰时间、平均渡越时间比较差异有统计学意义(F=4.2460、25.818、16.571，均P<0.05)。同一时间点时，靶向超声造影的峰值强度和平均渡越时间高于普通超声造影，达峰时间低于普通超声造影(均P<0.05)。

蔡振华和足球的渊源要从2010年说起。那是中国足坛的“至暗时刻”，当时中国足坛的三位重量级高官——谢亚龙、南勇、杨一民被捕，前两人是中国足协原专职副主席，杨一民则是中国足协副主席。与此同时，申思、江津、祁宏、李明四名前国脚也被公安机关带走。

表1 普通与靶向超声造影造模后不同时间点峰值强度比较(%)

表2 普通与靶向超声造影造模后不同时间点达峰时间比较(s)

表3 普通与靶向超声造影造模后不同时间点平均渡越时间比较(s)

2.4 造模后不同时间点裸鼠血管新生分子蛋白、细胞增殖蛋白及细胞侵袭蛋白相对表达量比较 见表4。造模后不同时间点，裸鼠血管新生分子蛋白(VEGFR1、Tie-2)、细胞增殖蛋白(Cyclin D1、ELF5)、细胞侵袭蛋白(IGFBP2、E-cadherin)相对表达量比较差异有统计学意义(均P<0.05)。

表4 造模后不同时间点裸鼠血管新生分子蛋白、细胞增殖蛋白及细胞侵袭蛋白相对表达量比较

2.5 靶向超声造影参数与癌细胞生长的相关性 见表5。Spearman相关性分析显示，靶向超声造影峰值强度与VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈正相关，与ELF5呈负相关(均P<0.05)；达峰时间与VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈负相关，与ELF5呈正相关(均P<0.05)；平均渡越时间与VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈正相关，与ELF5呈负相关(均P<0.05)。

表5 靶向超声造影参数与癌细胞生长的相关性

3 讨 论

卵巢癌是常见的妇科生殖系统恶性肿瘤，在育龄女性中发生率较高，主要是由于此阶段卵巢胚胎发育、内分泌功能会使得组织学分类多，在以上组织学分类中上皮性肿瘤占比较高。因卵巢解剖位置较深，因此常规检查时不能触及，此外在起病初始患者临床症状不明显，使得卵巢癌的疾病检出率较低，许多患者确诊时已是晚期，错失了救治机会[6-7]。临床上对卵巢癌患者多采用手术联合化疗的方法治疗，卵巢癌1期者生存率约90%，而随着疾病进展，患者的复发率、耐药率增加，预后不佳，使得其生活质量、生存率不高[8-9]。患者的疾病预后与进展会受到分化程度、组织类型、临床分期等情况的影响，不同患者的疾病发展不同，结局、预后也截然不同。因此，对于卵巢癌，早期发现、确诊并给予患者合适的治疗方法非常重要[10]。

对于卵巢癌，临床上常用的检测方法包括肿瘤标志物、超声、计算机断层扫描、磁共振成像等，其中卵巢标志物因其敏感性不佳使得手术选择不佳，而超声、计算机断层扫描、磁共振成像可具体显示肿瘤形态学，还可分析肿瘤与周边组织相关性，确定肿瘤分期[11]。其中，超声是廉价、安全、无创的卵巢肿瘤检查方法，既可克服二维超声局限性，又可显示肿瘤内部的低速和细小血管的低速血流状态，评价肿瘤内部和分隔上的血流情况[12-14]。因此，临床上多通过常规超声定性判断，但其存在一定不足。而超声分子成像技术可对早期肿瘤血管成像，尤其是靶向超声较CT、正电子发射断层扫描等有其独特优势[15]。

本研究显示，靶向超声造影的峰值强度、达峰时间、平均渡越时间在造模后不同时间点比较差异有统计学意义；而在同一时间点时，普通与靶向超声造影的峰值强度、达峰时间、平均渡越时间比较差异也存在统计学意义。其中，峰值强度能够反映肿瘤血管中的微泡总量[16]；达峰时间可间接反映肿瘤血供系统在静脉端的阻力[17]；平均渡越时间可反映造影剂的洗脱速度[18]。靶向超声造影与普通超声造影相比，其更持久，更清晰，显影强度更高。此外，靶向超声造影可对血管形态特征分布进行动态观察，也可从无创、准确分子水平定量、定性评估参与生理或病理过程中的分子。

此外，本研究中靶向超声造影的造影参数在不同时间点存在差异性，其可反映肿瘤不同时间点的血流情况，说明随着移植瘤生长时间的增长，瘤体体积、细胞量不断增大，因此在移植后第20、30天时新生血供较多。而随着时间延长，晚期新生血供已不能满足瘤体增长速度，从而出现了部分坏死，也使得移植后第40、50天时的造影参数出现降低，因此靶向超声造影可量化肿瘤血管的变化规律及特性，为早期定性诊断卵巢癌提供可视化方法。

综上所述，不同时期靶向超声造影显影优于普通超声造影，超声造影参数与癌细胞生长有一定的相关性，有助于卵巢癌的早期诊断。