独活寄生汤对胶原性骨关节炎大鼠干预机制

杨 茜，宁 珑，许春萍，颜明丽，杨沛林

(1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省中西医结合医院，云南 昆明 650224)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是以关节软骨组织变性、软骨下骨硬化、骨赘形成、滑膜增厚为特征的一种退化性关节疾病，常见于老年人，且发病率随着年龄的增长而急剧上升。中医认为，OA属于“痹证”范畴，是由于风寒湿邪客于经络关节，气血运行不畅，又兼肝肾不足，气血亏虚，筋骨失养所致肢体关节疼痛，屈伸不利[1-4]。近年来，善于祛风湿、止痹通的中草药及其复方因其治疗成本低、不良反应少，已成为治疗和缓解骨性关节炎的研究热点。独活寄生汤由独活、桑寄生、杜仲、茯苓、金钱草等15 味中药组成，该方最早记载于唐代医籍《备急千金要方》，用于治疗“痹症”，素有“痹家金方”之美誉。独活寄生汤具有祛风湿，止痹痛，益肝肾，补益气血的功效，主要用于治疗关节痛综合征[5-7]。现代药理研究证实，独活寄生汤具有抗炎镇痛，消除自由基，改善微循环和免疫调节等作用[8-10]。因此，本研究通过建立大鼠胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型，探讨独活寄生汤对Ⅱ型胶原诱导的骨关节炎模型大鼠治疗作用及可能的机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：50只雄性SD大鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，饲养于云南中医药大学动物房中，室温18～24 ℃，湿度40%～60%，每天定时更换垫料，给予饲料、水，维持正常昼夜节律。本研究经过云南中医药大学实验动物福利与伦理委员会批准同意。实验动物合格证号430727210101882986、许可证号SYXK(滇)K2022-0004。

1.1.2 实验药物与试剂：牛/鸡二型胶原(CⅡ)；弗氏完全佐剂(批号1001131105，Sigma公司)；醋酸地塞米松片(批号200920，浙江仙琚制药股份有限公司)；独活、桑寄生、牛膝、杜仲、党参、茯苓、当归、芍药、桂枝、防风、川芎、熟地、细辛、秦艽、甘草(购于云南慈慧药业有限公司)；大鼠肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫检测试剂盒(批号20210817，南京建成生物工程研究所)；大鼠白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)酶联免疫检测试剂盒(批号20210817，南京建成生物工程研究所)；冰醋酸(批号150811，天津市风船化学试剂科技有限公司)；多聚甲醛(批号20100422，广东光华化学厂有限公司)。

1.1.3 实验仪器：天平(型号Secura2250，德国Sartorius公司)；加热磁力搅拌器(型号RCT Basic，德国IKA公司)；高速低温离心机(型号CF16RX，日本Hitachi koki公司)；药品冷藏箱(型号YY-1200，沈阳市医疗设备)；酶标仪(型号Infinite M2000，瑞士Tecan公司)；实验室超纯水机(型号AK-RO-C2)；组织包埋盒(江苏世泰实验器材有限公司)；石蜡脱水机(型号Excelsior AS，美国Thermo fisher scientific公司)；石蜡切片机(型号Microm HM，美国Thermo fisher scientific公司)；石蜡包埋机(型号Histostas，美国Thermo fisher scientific公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 CIA模型的建立：雄性SD大鼠50只，适应性喂养3 d后，以随机数字表法选取8只作为正常对照组，余42只采用牛/鸡CⅡ诱导大鼠CIA模型。模型建立方法：在大鼠左后肢足跖内皮下注射0.1 ml胶原乳剂致炎，第7天在大鼠尾、背多点皮下注射0.1 ml该胶原乳剂作为激发注射。正常对照组在同一部位同样方法注射0.1 ml的0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 分组及给药：模型成功标准，通过观察足趾肿胀程度、关节炎指数统计关节炎成模率；以随机数字表法将建模成功的大鼠分为模型组、地塞米松组、独活寄生汤组。地塞米松组给予每天 2 ml/100 g地塞米松，灌胃；独活寄生汤组给予每天 2 ml/100 g独活寄生汤，灌胃；正常组、模型组给予等体积蒸馏水，灌胃。持续给药30 d，每7 d测量1次足趾肿胀。

1.3 指标检测

1.3.1 一般体征和脾脏湿重及指数：观察各组大鼠饮食、活动状况、皮毛光泽、体重变化，在治疗后每天测量大鼠体重；每5 d采用水容积测量大鼠左后足跖容积；取脾脏称量湿重，计算脾脏指数。脾脏指数=(脏器重量/动物体重)×100%。

1.3.2 关节炎指数：从致炎后第7 天起，每隔7 d采用关节炎评分计算关节炎指数(Arthritis Index，AI)。关节炎评分标准：0分，无红肿；1分，趾关节红肿；2分，趾关节、足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀；每肢AI最高分数为4分，四肢AI之和代表每只大鼠的AI，最高值为16分。

1.3.3 大鼠血清IL-6、TNF-α水平检测：给药结束后，称量各组大鼠体重，测量大鼠足趾体积。麻醉后处死大鼠，取血清，严格按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清IL-6、TNF-α水平。

1.3.4 HE染色检测踝关节病理变化：大鼠踝关节用4%多聚甲醛固定，脱钙液脱钙后，进行石蜡包埋，切片，苏木精伊红染色，光镜下观察关节病理学变化。

1.4 统计学方法 本实验所得数据均采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠体征和脾脏湿重及指数比较 见表1。经观察大鼠状况良好，饮食量、饮水量、体重和二便一切正常，且外观、皮毛、行为、呼吸均正常。与正常组比，模型组大鼠脾重、脾脏指数均有降低趋势，组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与模型组比较，地塞米松组大鼠脾重较低，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组大鼠脾重及脾脏指数比较

2.2 各组大鼠关节指数比较 见表2。与正常组相比，不同时间点模型组大鼠关节指数均高，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。第14天、第21天、第28天、第35天地塞米松组的关节指数均低于模型组，第28天、第35天独活寄生汤组的关节指数均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组大鼠关节指数比较

2.3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 见表3。模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。地塞米松组、独活寄生汤组大鼠血清IL-6、TNF-α水平低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表3 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较(ng/L)

2.4 各组大鼠踝关节病理组织情况比较 见图1。大鼠麻醉后，进行取材，HE染色后观察各组大鼠关节病理学变化。与正常组比较，模型组发生细胞侵蚀、骨质侵蚀、形成血管翳；与模型组比较，地塞米松组、独活寄生汤组细胞侵蚀及骨质侵蚀较轻，并且未形成明显血管翳。

图1 各组大鼠踝关节肿胀病理表现(HE染色，×100)

3 讨 论

OA属于中医学“痹症”“骨痹”范畴[11]。《备急千金要方》云：“夫腰背痛者，皆由肾气虚弱，卧冷湿地当风所得也，不时速治，喜流入脚膝，为偏枯冷痹缓解痉重，或腰痛挛脚重痹”[12]，提出了久痹出现气血不足累及肝肾之说，因此本研究选用独活寄生汤进行治疗，方中独活、桑寄生、杜仲可祛风湿，补肝肾，强筋骨，且牛膝还可活血以通利关节；当归、川芎、地黄、白芍、人参可益气养血。该方祛风散寒除湿与补肝肾益气血之药配伍，正邪兼顾，具有祛脏腑之风寒湿，除经络之顽痹，益肝肾、补气血的功效[13-14]。

有研究表明，轻度慢性炎症在本病发展中起着核心作用[15]。在炎症状态下，软骨细胞表达并分泌各种炎症细胞因子，大量存在于血浆、滑液中，导致关节破坏性改变并诱发痛觉过敏，加速关节软骨的炎症损伤[16-18]。炎症因子如IL-6、TNF-α是影响基质降解、滑膜炎症的首要因素[19]。TNF-α是滑膜、软骨下骨和软骨炎症级联反应的主要加重因子[20]。研究表明，在体内和体外OA模型中，TNF-α可抑制软骨胶原产生，抑制软骨修复[21]。IL-6 是介导软骨破坏的重要因子，可刺激滑膜细胞及软骨产生胶原酶及前列腺素，增强关节炎症反应，IL-6抑制或敲除可减轻小鼠膝关节软骨破坏[22-23]。本研究结果显示，给予独活寄生汤治疗可降低炎症因子IL-6、TNF-α水平，抑制炎症因子对软骨细胞、软骨基质的破坏，缓解OA症状。因此，抑制软骨细胞炎症和凋亡的药物可能对OA有潜在治疗作用，但仍需深入研究。

疾病的动物模型能够控制混杂因素，如遗传背景、食物摄入和环境影响等，因此有助于识别与人类疾病相关的生物变化，利于药物研发。CIA 是一种用同源或异源性Ⅱ型胶原免疫动物而引发的慢性、多发性关节炎，通常在动物的免疫部位(尾根部、背部和跖部)进行皮下注射[24-25]。目前，该模型已被广泛用于确定自身免疫的潜在致病机制。Ⅱ型胶原诱导的CIA模型病理特征包括滑膜增生、单核细胞浸润、软骨下骨硬化等与人类OA相似，且该模型较为稳定，是筛查治疗OA药物的理想模型[26]。因此，在本研究中，通过向大鼠注射胶原乳化剂复制大鼠CIA模型，在首次注射胶原乳化剂1周后再次以相同剂量于尾根部皮内注射加强免疫以确保诱发CIA高发病率，成功复制CIA模型后，本研究给予独活寄生汤连续30 d灌胃治疗，结果显示，给予独活寄生汤治疗可降低CIA大鼠关节炎指数，减轻足肿胀程度。

综上所述，独活寄生汤可显著减轻Ⅱ型胶原诱导的OA 症状，其抗炎机制可能是抑制炎症因子IL-6，TNF-α表达。