猪伪狂犬病病毒变异株（RP02 株）3 种佐剂灭活疫苗制备及其安全性评价

车艳杰，康亚男，吕茂杰，李建丽

天津瑞普生物技术股份有限公司，天津 300308

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种以发热、奇痒（猪除外）、脑脊髓炎为主的急性传染病[1]。不同日龄猪均可感染发病，常引起妊娠母猪流产、死胎；15 日龄内仔猪死亡率高达100%，表现出体温突然升高、呕吐、腹泻、精神高度沉郁；成年猪感染率较低，不表现临床症状或仅有轻微体温升高[2-3]。据报道，2011 年开始，我国出现了猪伪狂犬病病毒变异株，造成现有的商品化疫苗保护效力下降，并呈现一定范围的流行和发病，引起严重的母猪繁殖障碍和初生乳猪死亡，给我国养猪业造成了较大的经济损失[4]。天津瑞普生物技术股份有限公司研究院（以下简称瑞普生物研究院）从临床发病猪只中分离到多株PRV 变异株，并筛选了1 株免疫原性优良的疫苗候选株（RP02 株）。本研究根据临床需求和瑞普生物研究院前期基础性研究，制备了3 种佐剂的变异株疫苗，并采用本动物和非本动物相结合的双重安全评价法，评价3 种佐剂疫苗的安全性，以期为后续PRV 变异株灭活疫苗的研制提供数据支撑和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）毒种与细胞。猪伪狂犬病毒变异株（RP02株）和ST 细胞，均由天津瑞普生物技术股份有限公司研究院鉴定和保存。

2）佐剂。佐剂1 属于水溶性载体类，佐剂2 属于研究院自主研制的水溶型，均由天津瑞普生物技术股份有限公司制备和保存；佐剂3 属于油乳剂W/O/W 型，购于赛彼科公司。

3）试验动物。4～5 周龄SPF 级BALB/c 小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。3～4 周龄仔猪（PRV 抗原、抗体双阴性），购自天津某养殖场。

4）其他材料。新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程股份有限公司；胰酶和DMEM 购自Gibco公司。

1.2 试验方法

1）疫苗制备。将培养48 h 的ST 细胞，按培养体积1%比例接种猪伪狂犬病毒RP02 株，待细胞病变达到90%以上时收获病毒液。反复冻融2 次后，经膜包浓缩和分子筛纯化后得到纯化病毒液，再经4%二乙烯亚胺（BEI）灭活，将灭活检验合格病毒液分别按佐剂使用说明配制3 种佐剂疫苗，备用。配苗时，灭活前抗原含量不低于108.5TCID50/mL。

2）病毒含量测定。将病毒液样品用含2%新生牛血清的DMEM 培养液做10 倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-94 个稀释度，每个稀释度分别接种生长良好单层ST 细胞的96 孔细胞板，每个稀释度6孔，100 μL/孔，同时设正常细胞对照6 孔，置37 ℃含5% CO2培养箱中吸附1 h，而后每孔补加含2.0%新生牛血清的DMEM 维持液100 μL，置37 ℃含5% CO2培养箱中继续培养4～5 d，每天观察并记录细胞病变（CPE）孔数，根据每个稀释度的病变细胞孔数，按Reed-Muench 方法计算TCID50。

3）灭活检验。采用细胞法进行灭活检验。取灭活后的病毒液，10 倍稀释后接种生长良好单层BHK-21 细胞的6 孔细胞板，平行接种2 孔，每孔1.0 mL，置37 ℃含5% CO2培养箱吸附1 h，弃去液体，加入含2%新生牛血清的DMEM 培养液2.0 mL，同时设病毒对照和正常细胞对照，37 ℃培养含5%CO2培养箱中继续培养4～5 d，观察细胞病变情况，判定病毒是否完全灭活。

4）疫苗检验。制备疫苗按照《中华人民共和国兽药典》三部附录进行相关检验，应符合规定。

5）安全性评价。①小鼠安全性评价。选取4～5周龄BALB/c 小鼠40 只，随机分成4 组，每组10只。第1～3 组分别接种3 种佐剂疫苗，背部皮下注射，接种2 次，间隔14 d，0.5 mL/次，第4 组为空白对照组。于首免后14 d 和二免后14 d，各组分别随机抽取5 只小鼠剖检，观察注射部位及疫苗吸收情况。②仔猪安全性评价。选取3～4 周龄PRV 双阴性猪只20 头，随机分成4 组，第1～3 组分别接种3 种佐剂疫苗，颈部肌肉注射，4.0 mL/头，第4 组为空白对照组。连续观察14 d，记录试验猪只的精神状态、采食、行为活动；同时，从注射当日连续测温7 d，观察试验猪只的体温变化；14 d 后试验猪进行剖检，观察注射部位及疫苗吸收情况。

2 结果与分析

2.1 抗原含量测定

将ST 细胞培养获得30 L 病毒液（RP02 株），按Reed-Muench 方法测定和计算其TCID50，结果表明，培养毒液的病毒含量为109TCID50/mL，符合配苗标准要求。

2.2 灭活检验结果

采用细胞法验证灭检效果，结果显示，灭活病毒液检验孔和正常细胞对照孔均无细胞病变，病毒阳性对照孔出现融合、拉网、崩解等典型的细胞病变（图1），结果表明，病毒液（RP02 株）已灭活完全，灭活工艺符合标准。

图1 PRV（RP02 株）病毒灭活前后细胞病变观察

2.3 疫苗成品检验

按照《中华人民共和国兽药典》三部附录进行3种佐剂疫苗相关检验。结果表明，制备的3 种佐剂PRV 变异株疫苗均符合规定（表1）。

表1 疫苗检验结果

2.4 安全性评价

1）小鼠安全性评价。从试验小鼠的精神状态、注射局部炎症和吸收程度3 个方面评价3 种佐剂疫苗对小鼠的安全性。3 组疫苗免疫2 次后，在观察期内，3 组免疫小鼠均行动敏捷、精神状态良好，未见被毛蓬乱、精神沉郁等眼观不良现象（图2）；首免后14 d 和二免后14 d，每组随机取5 只小鼠观察注射部位，3 组疫苗的注射部位均未见肿胀、起疱、结块等不良现象；注射部位剖检显示，佐剂1 疫苗组和佐剂2 疫苗组均吸收良好，而佐剂3 疫苗组仍有少量肉眼可见的未吸收疫苗（图3）。以上结果综合表明，在安全性上，佐剂1 和佐剂2 无差异，均优于佐剂3。

图2 小鼠注射疫苗后精神状态的眼观结果

图3 小鼠注射部位疫苗吸收情况观察

2）仔猪安全性评价。从临床整体观察、注射局部炎症反应、吸收效果和体温变化4 个方面评价疫苗对仔猪的安全性。疫苗免疫后在观察期内，3 组佐剂疫苗的试验猪只采食饮水均正常，精神状态良好，均未见精神沉郁、免疫不良反应等现象（表2）；注射部位也未见肿胀、硬结等局部不良炎症反应；疫苗吸收均良好，未见眼观可见的吸收不良现象；在体温方面，佐剂1 疫苗组和佐剂2 疫苗组均无明显的体温变化，但佐剂3 疫苗组，在免疫后1 d 出现一过性体温升高现象，见图4。以上结果综合提示，在安全性上，佐剂1 和佐剂2 无差异，均优于佐剂3。

表2 仔猪安全性评价结果

图4 注射后体温监测结果

3 讨 论

疫苗免疫仍是防控PRV 流行和危害的有效措施之一。随着近些年PRV 变异株的出现，PRV 变异株灭活疫苗得到了临床应用，获得了一定的临床效果。开发一种安全、高效的PRV 变异株灭活疫苗是当务之急。

关于PRV 变异株灭活疫苗的研究与开发，涉及PRV 变异毒株分离、鉴定、培养、免疫原性、灭活、佐剂等众多方面，其中免疫佐剂在PRV 变异株灭活疫苗的安全性和有效性方面起关键性作用。目前，最常用的动物用免疫佐剂可分为油乳剂类和水溶性类等，油乳剂类又分为水包油型（W/O）、油包水型（O/W）、水包油包水型（W/O/W）；水溶性类佐剂包括铝盐、聚合物、载体蛋白等载体类。本研究在天津瑞普研究院前期PRV 变异毒株的分离、鉴定、培养等研究的基础上，选择具有代表性的油乳剂类水包油包水型（W/O/W）、水溶性载体类卡波姆佐剂以及自主开发的水溶性佐剂，分别制备PRV 变异株灭活疫苗，并通过本动物和非动物开展双重安全性试验验证佐剂的安全性，旨在为开发新型、安全、高效PRV变异株灭活疫苗提供数据支撑。

水性佐剂疫苗因免疫副反应低、吸收速度快等特点逐渐受到临床使用者的认可。本试验结果表明，在本动物和非本动物的安全性方面，水溶性佐剂无论是载体类卡波姆佐剂还是自主研发的佐剂，均优于油乳剂类水包油包水型（W/O/W）。研究表明，卡波姆分子链相互共价交联，构成高分子聚合物，具有一定的缓释作用[5]。其既能明显刺激动物机体细胞免疫应答，又能有效地激活体液免疫应答，已在猪圆环病毒、猪支原体肺炎、猪塞内卡病毒和禽流感疫苗研究中得到验证[6-9]。本研究结果可为后续基于卡波姆佐剂的疫苗研发提供技术参考。