竹节参总皂苷通过肾素-血管紧张素系统抑制肾癌细胞增殖的研究

茹松甲, 刘晓丽, 李胜超

(辽宁省抚顺市中医院 肾内科, 辽宁 抚顺, 113006)

竹节参总皂苷(TPJS)是五加科植物竹节参中的主要活性成分，是一种常用中药，对心血管系统、免疫系统及中枢神经系统具有广泛的药理作用，被认为对许多人类癌症具有有效的抗肿瘤特性[1]。肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体重要的内分泌系统[2], 可调节血压和电解质平衡。研究[3]表明, RAS可能参与许多病理生理过程，例如维持血压/血容量稳态和离子液体平衡、系统发育进程、生长促进和血管生成、个体发育和系统发育。研究[4]表明，RAS在癌症的发展中也扮演着重要的角色。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是已知的RAS通路的主要效应器，在调节癌症炎症和肿瘤血管生成中具有重要的作用[5]。AngⅡ1型受体(AT1R)介导的AngⅡ活性在调节RAS途径中发挥中心作用[6-7]。RAS通路主要通过血管紧张素转化酶-AngⅡ-AT1R轴发挥作用，可促进肾癌形成、增殖及转移[8]。血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)是肿瘤相关血管生成中的重要分子，具有激活内皮细胞转移并增加血管通透性的作用[9-10]。环氧合酶-2(COX-2)是一种参与癌症发生和肿瘤进展的关键酶，尤其是在新生血管生成和淋巴血管侵袭中[11], 并且通过不同于VEGF轴的机制也被检测到表达上调[12]。目前，关于TPJS抑制肾癌细胞系增殖和诱导其凋亡的作用机制的研究较少。本研究检测RAS中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的表达水平，并分析其可能的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和TPJS处理

人肾癌ACHN和A498细胞株购自广州詹尼欧生物科技有限公司。ACHN细胞培养在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基中。A498细胞培养在含10%FBS的RPMI 1640培养基中。2种细胞系均在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。TPJS由中山大学生命科学院天然产物实验室提供，并通过标准品检测。TPJS在DMSO中溶解，并在测定中将DMSO稀释1 000倍，最终DMSO最大浓度为0.1%, 并排除DMSO自身对细胞的影响，形成浓度为100 mmol/L的原液，随后在培养基中稀释至实验所需的浓度。

1.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

TPJS处理ACHN和A498细胞后，在4 ℃下400×g离心15 min后收集培养液，在80 ℃下保存液体上清液进行ELISA。ACHN、A498细胞细胞溶解于十二烷基硫酸钠(SDS)裂解缓冲液中，随后测定总蛋白提取液中AngII、AT1R、VEGF、COX-2的浓度。AngII酶联免疫试剂盒、AT1R酶联免疫试剂盒和COX-2酶联免疫试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 细胞增殖实验

使用细胞计数试剂盒检测TPJS对肾癌细胞增殖的影响。ACHN和A498细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，加入培养液100 μL。在吸附24 h后，添加不同浓度的TPJS, 分别持续12、24、48 h。取出培养基，采用100 μL含有CCK-8试剂的培养基在37 ℃下孵育2 h。使用分光光度对细胞进行检测。

1.4 细胞凋亡检测

使用异硫氰酸荧光素Annexin V凋亡检测试剂盒，根据制造商的方案对凋亡细胞进行定量。细胞培养于6孔板上，密度为每孔1×105个细胞。生长24 h后，采用不同浓度的TPJS处理细胞，并采集细胞进行凋亡检测。未处理的细胞作为阴性对照。

1.5 菌落形成试验

将细胞按每孔1×103个接种于6孔板上，不同浓度TPJS处理6 h后培养2周。采用4%多聚甲醛固定细胞后，计数形成的菌落数量，并用结晶紫染色液染色。

1.6 Caspase Glo 3/7测定

将细胞按每孔5×103个接种在96孔板上，并暴露于不同浓度的TPJS中。每孔加入等量的Caspase Glo 3/7试剂，室温避光孵育30 min, 采用发光仪对其进行测量。

1.7 细胞毒性试验

根据制造商的协议，使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒评估TPJS的细胞毒性。细胞置于96孔板中培养, TPJS处理24 h, 400×g离心5 min, 收集培养液。将上清液(每孔120 μL)转移到另一个96孔板，每孔加入60 μL LDH检测试剂。室温避光孵育30 min, 采用分光光度计测量浓度。

1.8 Western Blot分析

检测凋亡相关蛋白Caspase 9、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2样蛋白4(Bax)在肾癌细胞中的表达。采用放射免疫沉淀分析缓冲液裂解细胞，然后在4 ℃提取总蛋白。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏氟乙烯膜上。室温下采用5%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水和Tween 20(TBS-T)中封闭细胞膜1 h, 然后采用兔抗人Caspase 9(1∶1 000, 购自英国Abcam公司)和Bcl-2兔单克隆抗体(1∶1 000, 购自英国Abcam公司)。采用兔抗人GAPDH多克隆抗体(1∶2 000, 购自英国Abcam公司)作为内参。采用TBS-T洗涤3次，每次5 min, 采用过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000, 购自英国Abcam公司)孵育1.5 h。最后，在暗室中采用ECL发光溶液(购自Solarbio公司)涂覆膜并置于凝胶成像仪中拍摄。

1.9 统计学分析

采用SPSS 24.0进行统计分析, ELISA、菌落形成和Caspase-Glo 3/7检测重复3次, CCK-8和细胞毒性试验共进行4次。采用单因素方差分析和双侧t-test检验评估2组数据在所有实验中的差异。计量数据以均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TPJS抑制肾癌细胞的生长

本研究采用CCK-8法测定细胞活力，观察TPJS对肾癌细胞增殖的影响。与采用0 μmol/L TPJS处理的细胞相比，采用25、50、100、150、200 μmol/L TPJS处理的肾癌ACHN和A498细胞12、24、48 h后，细胞活力受到显著抑制，并呈剂量和时间依赖性的特点。细胞形态学分析结果显示，未经处理的肾癌细胞生长良好，而经TPJS处理的细胞形态扭曲、变圆并发生凋亡。TPJS治疗6 h后，菌落形成试验结果显示，与0 μmol/L TPJS对照相比，竹节参总皂苷治疗6 h后菌落形成显著减少。见图1。

2.2 TPJS诱导肾癌细胞凋亡

为阐明TPJS对肾癌细胞凋亡的作用，分别测定了细胞毒性、Caspase 3/7活性、细胞凋亡及Caspase 9、Bcl-2和Bax的表达。结果显示，与0 μmol/L TPJS处理的细胞比较，不同浓度TPJS处理后显著增强了细胞毒性和Caspase 3/7活性。流式细胞术检测结果显示, TPJS治疗24 h后可诱导肾癌细胞凋亡。TPJS可以上调Caspase 9和Bax的水平，下调Bcl-2的水平。见图2。

2.3 TPJS以剂量依赖性方式抑制AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的表达

采用不同浓度TPJS处理肾癌ACHN和A498细胞24 h后，测定细胞中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的水平。与采用0 μmol/L TPJS处理的细胞相比, ACHN和A498细胞系经TPJS治疗后的AngⅡ、AT1R、VEGF 和COX-2水平显著降低，并呈剂量依赖性的特点。见图3。

2.4 AT1R和VEGF可能逆转TPJS诱导的肾癌细胞生长抑制和凋亡

为了确定AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2是否可以逆转TPJS诱导的肾癌细胞生长抑制和凋亡，当细胞暴露于100 μmol/L TPJS时，将其与AngⅡ (2 pg/mL)、AT1R (5 pg/mL)、VEGF (2 pg/mL)和COX-2 (0.5 ng/mL)共孵育。结果显示, AT1R和VEGF可逆转TPJS对细胞生长的抑制作用，且细胞凋亡试验结果与细胞生长结果相似。相反, AngⅡ和COX-2在TPJS诱导的细胞生长抑制和凋亡中未检测到相关作用。见图4。

3 讨 论

作为一种自由基清除剂和抗氧化剂, TPJS被认为是多种癌症的有效抗癌化合物，例如肺癌[13]、胃癌[14]、肝癌[15]等。本研究发现TPJS可能以时间和剂量依赖性的方式抑制肾癌细胞的生长，并且还证实了TPJS通过调节凋亡相关蛋白Caspase 3/7/9、Bcl-2和Bax诱导肾癌细胞凋亡，经TPJS处理后AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2水平降低，进一步强调了AT1R和VEGF在TPJS诱导的细胞凋亡中的重要性。

既往认为RAS是一种内分泌系统，其功能仅限于调节血压和电解质平衡。然而，近期研究[16]表明局部RAS可能参与调节多种生理和病理过程。在RAS系统中, AngⅡ被认为是一种关键的生物肽，具有2种主要的特异性受体亚型，包括AT1R和AT2R。作用于AT1R的AngⅡ在调节RAS的大多数作用中具有核心机制[17]。研究[18]表明, RAS通过AngⅡ/AT1R途径参与生物活性。同时，针对AngⅡ/AT1R途径的血管紧张素转化酶抑制剂及血管紧张素受体拮抗剂类药物治疗不仅可以对心血管疾病起作用，还可以改善癌症患者的生存预后[19]。影响RAS系统AngⅡ及AT1R轴的药物也可以通过抑制肿瘤微环境和肿瘤异常新生血管的生成，从而减少肿瘤细胞的增殖与转移[20]。此外, RAS在肾癌肿瘤微环境(TME)中的基质细胞中也会存在表达，例如内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞及树突状细胞等。这些基质细胞中局部RAS活性是TME免疫抑制的强诱导剂[19]。因此，肾癌中RAS也是治疗的关键靶点。本研究中, TPJS治疗后测定了AngⅡ和AT1R水平，结果表明, AngⅡ和AT1R在细胞中表达下调。VEGF和COX-2是RAS中重要的下游调节因子[21-22], 本研究还发现TPJS处理的细胞中VEGF和COX-2受到抑制，与既往研究[23]结果类似。RAS抑制可能是TPJS诱导肾癌细胞凋亡过程中的重要事件。

RAS已被研究[24-25]证实参与肿瘤的发生和发展。例如, AngⅡ能够促进肝内胆管癌上皮细胞向间质细胞的转化[26], 血管紧张素转换酶抑制剂抑制结直肠癌细胞的生长[27]。AngⅡ通过结合AT1R和细胞外信号调节激酶1/2信号在胰腺癌细胞中诱导VEGF; 此外, AngⅡ/AT1R可能增加VEGF的表达[28]。既往研究[29]显示, AT1R在肾癌中被确定为上调。研究[30-31]发现，在低氧条件下可检测到COX-2上调，并通过不同于VEGF轴的机制诱导血管生成。研究[1]报道, TPJS作为一种抗癌药物，通过RAS依赖途径发挥作用。本研究探讨AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2对TPJS诱导的肾癌细胞生长抑制和凋亡的影响，发现AT1R和VEGF可逆转TPJS诱导的肾癌细胞生长抑制和凋亡，但AngⅡ和COX-2对TPJS诱导的细胞生长抑制和凋亡无显著影响，表明AT1R和VEGF是TPJS诱导肾癌细胞增殖抑制和凋亡的关键因素。

综上所述, TPJS可抑制肾癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，降低肾癌细胞中AngⅡ、AT1R、VEGF和COX-2的生成，其中AT1R和VEGF可能逆转TPJS对肾癌细胞的作用。