微小RNA-155-5p通过靶向组蛋白去乙酰化酶1调控鼻黏膜上皮细胞上皮间质转化的实验研究

王忠巧, 高 妍, 司峰志

(新疆医科大学第二附属医院 耳鼻喉科, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)是耳鼻喉科常见的慢性炎症性疾病，发病率逐年升高，治疗效果欠佳[1]。CRSwNP病因复杂，机制尚不清楚，研究[2]表明，鼻腔黏膜上皮细胞的上皮间质转化(EMT)在CRSwNP发生中发挥至关重要的作用，因此探索鼻腔黏膜上皮细胞EMT过程，对于防治CRSwNP具有一定意义。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，在调控细胞新城代谢中扮演重要角色。多种miRNA在CRSwNP组织中差异表达，可调控鼻腔黏膜上皮细胞的生物学功能[3-5]。miR-155-5p参与调控多种疾病的EMT过程[6]。研究[7]表明, miR-155-5p可通过靶向凋亡诱导因子促进肾癌细胞的转移及EMT过程。但miR-155-5p是否可调控鼻腔黏膜上皮的EMT过程尚不清楚。本研究通过临床组织标本、细胞学实验观察miR-155-5p对鼻腔黏膜细胞EMT的影响，分析其与组蛋白去乙酰化酶1(SIRT1)的关系，以期为CRSwNP的防治提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年5月—2021年12月行鼻内镜手术治疗的患者50例为研究对象，其中男33例，女17例; 年龄18～66岁，平均(41.58±7.34)岁。纳入标准: 年龄大于18周岁者; 近2周内未使用抗生素、过敏药物、激素、免疫抑制剂等药物者; 对研究知情同意者。排除标准: 上颌窦后鼻孔息肉、霉菌性鼻窦炎、鼻咽癌等患者; 合并其他部位感染性疾病、败血症等疾病者; 合并过敏性疾病者; 合并自身免疫性疾病者; 合并恶性肿瘤者。根据是否合并鼻息肉分为CRSwNP组36例，慢性鼻窦炎不伴鼻息肉(CRSsNP)组14例。CRSwNP组患者男24例，女12例; 年龄18～64岁，平均(42.34±7.19)岁。CRSsNP组患者男9例，女5例; 年龄18～67岁，平均(42.21±6.83)岁。选取同期行鼻中隔偏曲手术治疗的20例鼻中隔偏曲患者为对照组，其中男11例，女9例; 年龄18～66岁，平均(42.44±87.74)岁。3组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。无菌条件下收集3组患者的鼻腔黏膜组织, -80 ℃保存待测。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 细胞、试剂及仪器

人鼻黏膜上皮细胞(HNEPC，长沙丰晖生物有限公司), RPMI-1640培养基(BI, 以色列), miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、阴性对照miR-NC、Vector质粒及引物(广州锐博生物有限公司)，野生型SIRT1载体(SIRT1-WT)、突变型SIRT1载体(SIRT1-MUT)(天津擎科生物有限公司), Lipofectamine 3000、TRIzol(Thermo公司，美国)，逆转录试剂盒、PCR试剂盒(Tarkara公司，日本),SIRT1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤黏蛋白(Fibronectin)及β-actin兔抗人抗体, Cy3标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德生物有限公司，天津天裔生物有限公司)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京Solarbio公司)，酶标仪(南京贝灯医疗器械有限公司), PCR仪(ABI公司，美国)。

1.3 细胞培养、转染及分组

HNEPC细胞使用RPMI-1640完全培养基培养。将miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、miR-NC及Vector质粒分别转染至细胞记为miR-155-5p组、miR-155-5p inhibitor组、miR-NC组、Vector组。

1.4 免疫荧光检测鼻腔黏膜组织、细胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达

将组织制备成5 μm的切片, 70 ℃烤箱过夜，依次通过二甲苯、梯度酒精进行脱蜡，将切片放在柠檬酸或乙二胺四乙酸(EDTA)中，高压进行热修复抗原，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次, 5%山羊血清封闭，室温下1 h, 加入一抗, 4 ℃冰箱过夜，第2天, PBS洗涤3次，加入荧光二抗，室温避光孵育1 h, PBS洗涤3次，二脒基苯基吲哚(DAPI)室温孵育15 min, PBS洗涤3次，封片，荧光显微镜下观察。制备细胞爬片, 4%多聚甲醛固定10 min, PBS洗涤3次，其他步骤同上。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞、组织miR-155-5p、SIRT1 mRNA表达水平

将各组组织从冰箱中取出，在液氮中研磨。取对数生长期的细胞，胰酶消化，离心。加入1 mL Trizol, 利用一步法提取总RNA, 检测RNA浓度、纯度，逆转录合成cDNA, 反应条件为: 30 ℃ 10 min, 42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。按照荧光定量试剂盒说明进行PCR, 循环条件: 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40个循环，构建溶解曲线，相对表达量用2-△△Ct法计算。内参使用U6。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 Western blot检测组织、细胞SIRT1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin的蛋白表达

收集各组细胞或组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)测蛋白浓度。配制5%浓缩胶及10%分离胶，每孔中加入20 μg蛋白, 70 V电压下将蛋白转移到聚氟乙烯(PVDF)膜上, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入SIRT1(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、Fibronectin及β-actin(1∶1 000), 4 ℃冰箱过夜，第2天PVDF膜洗涤3次，加入对应的二抗室温孵育1 h, 洗涤3次，加入发光液，上机曝光，使用Image J软件分析条带灰度值，用目的蛋白/β-actin的比值表示蛋白的相对表达量。

1.7 在线网站预测miR-142-3p与SIRT1的靶向关系

使用TargetScan在线网站(http://www.targetscan.org/)预测miR-142-3p与SIRT1的靶向关系。

1.8 荧光素酶报告实验

将Vector、miR-155-5p mimics质粒分别与SIRT1-WT、SIRT1-MUT载体共转染至293T细胞，继续培养48 h后，检测各组细胞荧光素酶相对活性。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 CRSwNP、CRSsNP及正常鼻腔黏膜组织miR-155-5p表达

CRSwNP组鼻腔黏膜组织miR-155-5p表达水平高于CRSsNP组及对照组, CRSsNP组鼻腔黏膜组织miR-155-5p表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2 CRSwNP、CRSsNP及正常鼻腔黏膜组织E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin及SIRT1表达

CRSwNP组鼻腔黏膜组织E-cadherin、SIRT1表达水平低于CRSsNP组及对照组, CRSsNP组鼻腔黏膜组织E-cadherin、SIRT1表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。CRSwNP组鼻腔黏膜组织Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平高于CRSsNP组及对照组, CRSsNP组鼻腔黏膜组织Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2。

2.3 各组细胞miR-155-5p表达水平

miR-155-5p组细胞miR-155-5p表达水平为(4.73±0.23), 高于Vector组的(1.03±0.03), miR-155-5p inhibitor组miR-155-5p表达水平为(0.32±0.02), 低于miR-NC组的(1.02±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 miR-155-5p对细胞EMT过程的影响

miR-155-5p组细胞E-cadherin表达水平低于Vector组, Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平高于Vector组，差异有统计学意义(P<0.01)。miR-155-5p inhibitor组细胞E-cadherin表达水平高于miR-NC组, Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.5 miR-155-5p与SIRT1的靶向关系

生物信息学分析发现, miR-155-5p与SIRT1mRNA 3′-UTR存在结合位点。miR-155-5p+SIRT1-WT组细胞SIRT1表达水平低于Vector+SIRT1-WT组，差异有统计学意义(P<0.01)。miR-155-5p组细胞SIRT1表达水平低于Vector组，差异有统计学意义(P<0.01)。miR-155-5p inhibitor组细胞SIRT1表达水平高于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

3 讨 论

慢性鼻窦炎是鼻腔黏膜慢性炎症为特征的疾病，根据是否合并息肉可分为CRSwNP、CRSsNP。近年来, CRSwNP发病率逐年升高，且治疗效果不佳，给患者的生活质量造成严重影响，因此探讨其分子机制迫在眉睫。EMT是指上皮细胞在各种刺激下发生向间质细胞表型转化的过程，在细胞增殖、侵袭及迁移中扮演重要角色。鼻腔上皮黏膜细胞受到炎症因子的刺激后会发生EMT过程，轻度EMT是上皮细胞正常、必要的过程，有利于抵御炎症反应，但炎症持续刺激引起的EMT可导致组织病理改变，最终形成CRSwNP。目前，多数学者认为, CRSwNP中存在EMT现象[8]。研究[9-11]发现, CRSwNP黏膜组织高表达EMT相关标记物。本研究结果显示，正常鼻腔黏膜组织、CRSsNP及CRSwNP中EMT过程越来越显著，提示EMT参与了CRSwNP发生发展过程，再次验证了其他人的研究结果。

miRNA是一类非编码RNA, 调控细胞的多种生物学功能。研究[12-14]表明，多种miRNA在CRSwNP鼻黏膜组织中差异表达。miR-155-5p是最近发现的一种miRNA, 参与调控细胞的增殖、凋亡，促进肿瘤细胞EMT过程及转移。研究[15]发现，miR-155-5p通过靶向GSK-3β抑制放疗诱导的肺纤维化的EMT过程。此外, miR-155-5p可通过调控EMT过程，促进口腔癌进展。但关于miR-155-5p在CRSwNP中的功能及作用机制仍不清楚。HNEPC是鼻腔抵御病原体、过敏原等各种有害刺激的重要屏障，在CRSwNP的炎症反应和鼻息肉的形成中扮演着重要角色，同时HNEPC过度增殖是鼻息肉形成的关键。本研究通过临床标本观察了miR-155-5p表达情况，结果显示, CRSwNP组织中miR-155-5p表达水平显著高于正常鼻腔黏膜组织及CRSsNP组，提示miR-155-5p参与了CRSsNP的发生发展过程。为进一步验证miR-155-5p与EMT的关系，本研究构建了过表达、敲低miR-155-5p质粒，并转染至HNEPC细胞，结果显示，上调miR-155-5p可促进细胞的EMT过程；反之，沉默miR-155-5p可抑制细胞的EMT过程，提示miR-155-5p可能通过调控鼻腔上皮黏膜细胞的EMT过程，参与鼻息肉的发生。

miRNA一般通过与下游的靶基因3′-UTR结合，调控靶基因的表达进而发挥作用。为进一步探讨miR-155-5p调控CRSwNP炎症反应的可能机制，本研究首先通过生物信息学预测了miR-155-5p靶基因，发现SIRT1基因mRNA 3′-UTR与miR-155-5p存在互补的碱基对。SIRT1属于Sirtuin蛋白家族中的明星分子，在呼吸道炎性疾病、肺纤维化疾病中发挥重要作用[16-17]。研究[18]发现,SIRT1与TGF-β1诱导EMT过程密切相关, TGF-β1可抑制细胞SIRT1表达，而上调SIRT1可抑制TGF-β1诱导的EMT过程。研究[9]发现, CRSsNP组织中低表达SIRT1,SIRT1可抑制鼻黏膜上皮的EMT过程。本研究结果显示, CRSwNP组织中SIRT1表达水平显著低于正常鼻腔黏膜组织及CRSsNP组，提示SIRT1在CRSwNP发生发展中发挥作用。LEE M Y等[19]发现,SIRT1在CRSwNP中低表达,SIRT1可通过下调缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的活性抑制EMT, 从而抑制鼻息肉的形成。研究[20-21]发现，多种miRNAs可靶向SIRT1调控细胞的EMT过程。因此，本研究采用荧光素酶实验进一步验证miR-155-5p对SIRT1的直接调节作用。结果表明, miR-155-5p与SIRT1具有负性靶向调控关系。上述结果证实,SIRT1是miR-155-5p靶基因, miR-155-5p可靶向抑制SIRT1表达，进而促进鼻腔黏膜上皮细胞的EMT过程。但本研究存在一定的局限性，首先本研究入选病例数较少，有待进一步增加样本量，以进一步验证miR-155-5p、SIRT1的表达情况。其次，对于miR-155-5p调控EMT过程的信号通路需要进一步探讨。

总之, miR-155-5p、EMT相关标记物在CRSwNP中表达升高，上调miR-155-5p可通过负性靶向调控SIRT1促进HNEPC的EMT过程。